试剂盒组成(50T) - 南通大学

1、实验一:遗传分子标记系列实验一、实验目的:通过不同个体基因组遗传分子标记的检测了解遗传标记多态性的应用意义，掌握检测技术方法。二、实验原理：在整个人类基因组中大约有5-10万个微卫星DNA的重复单位，微卫星DNA指DNA基因组中小于10个核苷酸的简单重复序列，广泛存在于真核基因组中，多数以2-6个碱基为核心单位、重复10-60次、长度50-150bp的串联重复排列的序列。由于微卫星DNA在基因组中分布广、数目多，在人群中表现出多态现象，且符合孟德尔遗传规律，因而为连锁分析提供了大量遗传标记，微卫星DNA因基因重复单位很短，所以又称短串联重复序列（short tandem repeats, ST

2、R）、简单重复序列（simple sequence repeat,SSR）。微卫星DNA由于基因重复单位小，重复次数有较大变化，所以又称为可变的串联重复单位。不同人体基因组卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此，形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，应用STR基因分型技术就可将不同个体进行区别，并可进行个体间的遗传学分析，从而进行个体识别和亲权鉴定。近年来，这一技术也广泛应用于考古学、遗传学以及肿瘤学等领域。三、实验器材与试剂PCR仪，恒温水浴箱，电泳仪，水平电泳槽，垂直电泳槽，离心机，移液器，旋涡振荡器，SE全血DNA小量提取试剂盒，TakaRa TaqTM PCR试剂盒，聚

3、丙烯酰胺凝胶电泳及银染试剂。四、实验步骤（一） 人基因组DNA的提取用TakaRa公司生产的Blood Genome DNA Extraction Kit从人全血中提取淋巴细胞的基因组DNA。操作步骤：1. 按处理样品数准备1.5 ml离心管，并各加入GenTLE Solution I 500 l。 2 把混合均匀的100 l血液，加入到分装好的GenTLE Solution I的离心管中，立即振荡数秒钟*1。 *1 不管处理多少样品，血液加入到GenTLE Solution I中，要立即进行振荡混合，否 则有可能降低收量。 3 室温放置10分钟以上，然后在室温*2条件下12,000 rpm以

4、上离心5分钟。离心时，请注意离心管在离心机里的摆放方向要统一，离心管的小耳朵朝上（见下图A）。此时几乎看不到DNA沉淀。 *2 若离心温度低，会对收量和纯度有影响，请于20以上离心。 4. 用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不清，紧贴在离心管外侧（带小耳朵一侧）的内壁上，除 去溶液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部（见下图B），注意不要吸走沉淀物。 5. 加入1 ml的GenTLE Solution II。此时GenTLE Solution II应沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中（见下图C）。 6. 轻柔地上下颠倒离心管数次*3，室温12,000 rpm以上离

5、心2分钟，用移液枪小心地除去上清溶液 （方法参见实验操作4.）。 *3 剧烈振荡将影响收量和纯度。 7. 向离心管中加入GenTLE Solution III 500 l，轻微振荡10秒钟充分混合。 8. 室温12,000 rpm以上离心5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管中。 9. 加入等体积（500 l）的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合。 10. 4、12,000 rpm离心5分钟，小心除去上清溶液*4。 *4 GenTLE Solution III中含有影响酶反应的物质，所以一定要除净上清溶液，但应注意不要吸走沉淀。 11. 加入1 ml的70%乙醇清洗沉淀，4、12,000 rp

6、m离心5分钟，小心地除去上清溶液（方法参见*4）。 12. 干燥沉淀*5。 *5 因为该方法提取的DNA较大，完整性好，所以请一定不要干燥过度。Tube中看不到有明显的液 体或没有乙醇气味后，就可以加入TE进行溶解。如果沉淀已经变白，说明干燥过度，此时加入TE，可能沉淀不能完全溶解，DNA的收量可能会受到影响。 13. 根据下一步实验需要，用1050 l适当的缓冲液（例如TE缓冲液等）溶解沉淀。图特别注意 操作步骤4（除去GenTLE Solution I和血液混合物）以及操作步骤9（除去GenTLE Solution III 和异丙醇混合物）的实验操作特别重要，请严格按操作方法进行。（二）

7、PCR反应扩增遗传分子标记以不同位点引物扩增不同个体遗传分子片断扩增A1：Primer F:5'-ATGAAATCAACAGAGGCTTGPrimer R:5'-ACTGCAGTCCAATCTGGGTA2：Primer F:5'-TTTTTGTATTTCATGTGTACATTCGPrimer R:5'-CGTAGCTATAATTAGTTCATTTTCA反应体系如下:引物A1或A2 110BufferdNTPTaqddH2O 25l 混匀 离心几秒用eppendorf PCR仪扩增,PCR反应条件如下:943 9430s 30s 7230s 723 35cycle

8、（三） 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法一、 电泳试剂：1、30%聚丙烯酰胺（29：1）丙烯酰胺29克，Bis 1克，ddH2O 100ml。2、10%过硫酸胺（现配现用）过硫酸胺0.1克，ddH2O 1ml3、TEMED4、5×TBETris 27克, 硼酸， EDTA（pH 8.0）10ml，定容至500ml。二、 银染试剂1、 固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。2、 0.2% AgNO3: AgNO3 1克，ddH2O 500ml。3、 1.5% NaOH: NaOH ，ddH2O 500ml。4、 37%甲醛。三、 配胶（6%）：12mlddH25&#

9、215;10%过硫酸胺 84l×2l×2室温凝固时间>6小时。四、 上样：每班将5个样本的A1和A2位点的PCR扩增产物上样。五、 电泳：×TBE六、 银染：1、 固定液固定10min。2、 水洗2min×3次。3、 0.2% AgNO3 100ml+37%甲醛50l，混匀，避光染色3050min。4、 水洗20秒×2次。5、 1.5% NaOH 100ml，加37%甲醛0.5ml，混匀，显色310min。6、 水洗若干次，终止显色。7、 用数码相机拍摄电泳图片，分析不同个体的A1和A2位点。注意事项：电泳时间：150V×1.5

10、h，溴酚兰的位置相当于40bp。银染后胶面积将膨胀10%。在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深。实验二、Northern杂交系列实验一、目的要求：通过Northern杂交系列实验，学习和掌握分子生物学研究中常用的实验手段，为今后的分子操作打下技术基础。二、实验原理：继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含poly A尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。这一技

11、术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。 与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。但与Southern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不

12、进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。本实验拟研究小鼠CRBN基因mRNA在肝、肺、心脏、脑、肾等组织的表达情况。三、实验器材与试剂杂交炉，PCR仪，恒温水浴箱，电泳仪，水平电泳槽，离心机，移液器，旋涡振荡器，压片暗盒，柯达X光胶片，Reverse Transcriptase M-MLV，TakaRa TaqTM PCR试剂盒，3S PCR Product Purification Kit ，DIG DNA 标记试剂盒，地高辛杂交检测试剂盒。四、实验步骤（一）总RNA的抽提 (

13、戴手袋操作)（1）取小鼠肝、肺、心脏、脑、肾组织。（2）取黄豆大组织加1mL TRIzol试剂，用超声打碎组织。(3) 每使用1mL TRIzol加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。 (4) 2-812000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60。 (5) 把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mL TRIzol加入0.5mL异丙醇，室温放置10分钟。 (6) 2-812000×g离心10分钟，离心前看不出

14、RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。 (7) 用75乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mL TRIzol至少加1mL75乙醇。2-8不超过7500×g离心5分钟，弃上清。 (8) 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解。加入25-200L无RNase的水或0.5SDS，用枪头吸打几次，55-60放置10分钟使RNA溶解，如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100的去离子甲酰胺溶解，-70保存。（9）紫外分光光度计检测总RNA浓度。 (10) 1%琼脂糖凝胶水平电泳检测抽提的总RNA质量。附：RNA质量检测提取的RNA需要对其质量和数量

15、进行检测。实验室常用的方法有紫外吸收值检测和电泳检测两种。紫外吸收检测试剂：TE ( 10mmol/L Tris, 1mmol/LEDTA)。dH2O试验程序1预热紫外分光光度计1020min.。2取两个2ml的狭缝石英杯，一个装入2mlTE溶液作为空白校正液，用来校正分光度计零点及调整透光度至100。3取8l RNA待测样品加入另一比色杯中，加ddH2O至2ml，用无菌石蜡膜堵住杯口，倒转混匀。4将两个比色杯置于分光光度计中，调入射光波长，用空白溶液分别调整T至100、OD至0，然后测定样品在260nm、280nm、230nm的OD值。RNA浓度和纯度分析浓度计算：对于单链RNA，OD260

16、1.0时，RNA浓度为40g/ml，按照上述稀释方式，即OD2600.1时，其RNA浓度为1g/ml。纯度分析：纯净的RNA样品其OD260/OD280的比值应介于1.72.0，小于此比值说明有蛋白或苯酚污染，如果比值大于2.0则可能被异硫氰酸胍污染；OD260/OD230比值应大于2.0，如果小于此比值说明有小分子及盐类污染。（二）逆转录（RT）逆转录用TaKaRa公司生产的Reverse Transcriptase M-MLV逆转录酶，该酶是通过基因重组技术克隆表达的RNase H活性缺失型M-MLV反转录酶。一般的野生型M-MLV（Moloney Murine Leukemia Viru

17、s）具有以下几种活性：依赖于RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNase H活性。由于RNase H能够催化降解DNA/RNA杂合体中的RNA，因此在cDNA第一条链的合成反应中可能会降解RNA/DNA杂合体中的模板RNA。 该酶M-MLV（RNase H）的RNase H活性缺失，延伸能力强，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。逆转录操作步骤：（戴手袋操作)1st-Strand cDNA合成的实验操作方法 1. Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量6 l。 试剂名称 使 用 量 模板RNA 1 ng1 g* Oligo(

18、dT)12-18 Primer（50 M） 或Random Primers（25 M） 或Specific Primer（10 M） 1 l RNase free dH2O up to 6 l * Total RNA的使用量一般为1 ng1 g；mRNA的使用量一般为10 pg1 g。 2. 70保温10分钟后迅速在冰上急冷2分钟以上。 3. 离心数秒钟使模板RNA/引物的变性溶液聚集于Microtube管底部。 4. 在上述Microtube管中配制下列反转录反应液。 试剂名称 使 用 量 上述模板RNA/引物变性溶液 6 l 5×M-MLV Buffer 2 l dNTP Mix

19、ture（各10 mM） 0.5 l RNase Inhibitor（40 U/l） 0.25 l RTase M-MLV（RNase H）（200 U/l） 0.25 l1 l* RNase free dH2O up to 10 l * 当起始模板RNA量500 ng时，RTase M-MLV（RNase H）的使用量应0.25 l。 5. 42保温1小时*。 * 以Random Primers作为反转录引物时应先进行30，10分钟反应，然后再在42条件保温1小时。 6. 70保温15分钟后冰上冷却，得到的cDNA溶液可直接用于2nd-Strand cDNA的合成或者PCR扩增等，PCR扩增

20、时cDNA溶液的使用量建议使用1 l5 l。 （三）CRBN探针标记1、DIG 标记CRBN探针应用地高辛DNA标记试剂盒进行CRBN探针的DIG 标记 地高辛DNA标记试剂盒是通过PCR反应将地高辛-dUTP 掺入DNA探针的快速标记方法。地高辛标记的探针高度稳定，用途广泛，可用于：非同位素的 Southern Blot、Northern Blot、菌落杂交和斑点印迹杂交分析等。地高辛DNA标记试剂操作方法 合成CRBN引物：Primer F: TAGTGAAAGTGAAAGCAATTGPrimer R: TAAGGAGCTGAATTCTCAATA（1）. 制备反应液: 正向引物 (5010

21、0 pmol) X l 反向引物 (50100 pmol) X l cDNA 模板(1020 ng/l) 1 l 10X PCR 缓冲液 2 l MgCl2 2 l Dig-dUTP 标记混合物 1 l H2O* X l Taq DNA聚合酶 0.5 l - 总体积 20 l *用蒸馏水补足20 l总反应体积 注意：如使用试剂盒中的对照引物组合，则用1l对照引物组合替换正向引物和逆向引物。（2）. PCR扩增程序：30个循环 94 30秒 56 1分钟 72 2分钟 末次循环后样品置于 20。（3）.检测扩增产物：制备1.0%的琼脂糖凝胶，取1l PCR产物稀释5倍后电泳检测。 （4）检测扩增

22、产物的地高辛掺入：取1 l 扩增产物，倍比稀释点样于尼龙膜上，根据自己偏好的方法进行检测，如化学发光或化学显色。2、用3S PCR Product Purification Kit 试剂盒纯化CRBN探针试剂盒组成：Components and SizeK141 (50 次)K142 (100次)3S ColumnCollection TubeSolution BSWash Solution( a)  TE( b)  50支50支25 ml22ml5 ml100支100支50 ml2x 22ml5 ml注：(a)用前须在Wash Solution瓶中加入50ml无水乙醇，充

23、分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。(b)TE pH8.0或者水均可以用于洗脱，但是水洗脱效率通常要低一些。测序样品请用水洗脱。(c) 该试剂盒不能用于从Agarose胶中回收DNA片段。 试剂盒DNA回收率： 3S 柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率，回收率在60%以上。 主要用途：1.去除PCR反应中 dNTPs，引物，矿物油和聚合酶等。2.从反应体系中去除限制性内切酶或修饰酶，回收和浓缩DNA。操作步骤：从PCR反应体系中回收PCR扩增产物：1. PCR结束后，从PCR反应管中将反应

24、液移至干净的1.5 ml Eppendorf离心管中，加入4倍体积的Solution BS混匀。无论样品量多少，最少需要使用400ul Solution BS。2. 将3S柱放入收集管中，把混合液转移到柱内，不要盖上离心管盖，室温放置2分钟；盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上离心管盖子)，用台式离心机高速离心（10000 rpm）1分钟。3.倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入600µl Wash Solution，高速离心（10000 rpm）1分钟。4.重复步骤3一次。5.倒掉收集管中的废液，将3S柱放

25、入同一个收集管中，高速离心（10,000 rpm）分钟。6.将3S柱放入一根新的1.5ml离心管中，在3S柱膜中央加30µl TE或水，不要盖上离心管盖，室温或37放置2分钟。提高洗脱温度有利于提高DNA 的洗脱效率。7.盖上离心管盖，10,000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20备用。81%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物纯化效果。（四）Northern杂交 概述 Northern杂交可以选用DIG或者BIOTIN标记的RNA探针或DNA探针，但RNA探针显示更强的杂交信号和更低的非特异性背景，因此只要可能，可尽量选用RNA探针。但由于R

26、NA探针在操作中的严格性比使用DNA探针更高。 因此大多数研究者仍使用DNA探针，在此情况下，建议使用Hyb高效杂交液以减少背景。 探针的浓度因目的基因的丰度和所采用的检测方法不同而有所差异。如采用化学显色法时，探针浓度建议为3080ng/ml，采用CSPD化学发光检测时，探针浓度建议为2050ng/ml，如果采用CDP-Star化学发光检测，由于灵敏度很高，因此，还要适当降低探针浓度(约1025ng/ml)。 1、 变性琼脂糖凝胶电泳试剂及其配制1. M EDTA: EDTA 加ddH2O至80ml, 调pH至8.0, 定容至100ml。2 50mM NaAc: NaAc 加ddH2O至50

27、0ml, 加DEPC 0.5ml, 振荡, 37过夜，高压灭菌。3 5×甲醛凝胶电泳缓冲液: MOPS 3-(N-玛琳代)丙磺酸 加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH调pH至7.0, 再加入 EDTA 10ml, 加DEPC H2O至500ml。无菌抽滤，室温避光保存。4 20×SSC: NaCl 、柠檬酸三钠，加ddH2O至800ml，用2N NaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。DEPC处理、高压灭菌。5. 2×SSC: 20×SSC 100ml加ddH2O至1000ml。DEPC处理,高压灭菌。变性琼脂糖凝胶电泳

28、操作步骤：将制胶用具及电泳槽用浸泡半小时以上，用DEPC处理水冲洗干净，晾干备用。1. 变性胶的制备：取琼脂糖g，加入ml，加热熔化，于保温状态下加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液8.0ml、37%甲醛ml，混匀、制胶。待胶凝固后，置1×甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。2l(约20-30g) ，加入5×l、甲酰胺10l，65温育15min、冰浴5min。加入EB（1g/l）1l、上样缓冲液2l。3. 电泳：上样，80V电泳（电泳时间约1.5hr左右）。电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。附：RNA样品质量分析

29、：完整的总RNA样品应呈现出三条条带，分别为28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA条带的亮度应约为18S rRNA条带亮度的2倍，这表明RNA样品比较完整，基本无降解。如果两条带的亮度反过来，则说明RNA样品已发生降解。如果在点样槽内或槽附近有荧光区带，则表明RNA样品中有DNA污染。2. 转膜和RNA的固定 转膜前的RNA琼脂糖凝胶电泳采用变性电泳方法，根据需要选用适当的分子量标准。1. 在完成电泳后，凝胶用DEPC-H2O淋洗除去甲醛，然后置于 2×SSC中浸泡1530分钟。 2. 搭建转膜平台：在大口盘中放入支持物如玻璃板，玻璃板应比支持物长。

30、剪一块滤纸，横放在玻璃板上，滤纸两端浸入盘中，用20×SSC浸湿，并向盘中加入足量的20×SSC。 3. 用刀将部分凝胶切去，并左下角切去一小块作为凝胶方位的记号。将凝胶置于平台中央，除去气泡。4. 剪一张尼龙膜，大小与凝胶相当，在无RNase的水中浸泡5分钟，然后将其置于凝胶表面。膜置于凝胶表面后不易挪动，膜与凝胶之间不应留有气泡。 5. 取两张与尼龙膜同样大小的滤纸，用20×SSC浸湿后置于膜上，用玻棒赶走气泡。将一叠略小于滤纸的吸水纸置于滤纸上，在纸上平放一玻璃板，然后在玻璃板上压一重物，室温下转膜46小时或过夜。注：可以使用其它的转膜仪器进行以上过程，请遵

31、循制造商的操作手册。 6. 转膜完成后，将膜置于一张干的滤纸上，用铅笔在膜上标记加样孔位置，用2×SSC洗膜，再置于干滤纸上使膜晾干。 7. RNA的固定： A） UV交联：；将膜用UV照射交联。总照射剂量依膜的不同生产商而异，请按照膜的使用说明书和UV CROSSLIKER的操作手册进行。 B） 真空烘烤固定：将膜夹在两张滤纸之间，80真空烘烤2小时。 3. 杂交A. 预杂交: 1. 将膜从包装袋中取出，用干净的剪刀将膜溴酚蓝以下的部分剪去。放入杂交袋中，在封口机上将杂交袋三面封口。 2. 加入65预热的Hyb高效杂交液5mL，排尽气泡，封口。放65水浴振荡杂交12小时。 3. 如

32、果使用杂交管杂交，则根据杂交管体积，加入适量的杂交液(5-10ml)。如果膜的大小适中，也可以用无菌的50ml离心管(BD公司)进行，5ml杂交液已足够。将杂交仪设定为65，8-15转/分钟预杂交12小时。 *如使用杂交管,将尼龙膜有颜色的一面向里B. 杂交: 1. 探针的处理： 将标记的探针放100煮10分钟，立即放冰浴冷却10分钟。 2. 将杂交袋从水浴中取出，剪去一角并尽可能的排尽袋中的预杂交液，取5mL Hyb高效杂交液，加入处理过的探针(1-3l/膜，1025ng/ml Hyb高效杂交液)，混匀。加入到杂交袋中，小心排尽气泡，封口，65水浴振荡杂交过夜。 3. 如果使用杂交管杂交，则

33、倒出预杂交液，另取适量的Hyb高效杂交液(5-10ml)，加入变性过的探针(1-3l/膜，或1025ng/ml Hyb高效杂交液)，混匀。加入到杂交管中，杂交仪设定为65，8-15转/分钟，杂交过夜。 C. 洗膜： 1. 剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20mL的2×SSC 0.1% SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。 2. 用镊子将膜转入×SSC 0.1% SDS溶液(先放50水浴预热)中，50水浴振荡洗涤两次，每次15分钟。 3. 用镊子将膜取出转入装有20mL洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5分钟。 4. 检测杂交信号 ：化学发光法 用地高辛杂交检测试剂盒 II试剂盒组成: 阻断液母液(10×) 50 ml 抗DIG-AP 酶结合物 10 l CDP-Star发光底物 100 l 检测缓冲液(5×) 50 ml 顺丁烯二酸缓冲液母液(2x) 500 ml Tween-20 3 ml 10% SDS 20 ml 20×SSC 100 ml * 使用前先用DEPC/无RNase水将5×检测缓冲液及2×顺丁烯二酸缓冲液母液稀释成1×工作液。 所