植物基因诱导剂-一种新型的基因开关─RU486诱导调控系统

1、植物基因诱导剂-一种新型的基因开关RU486诱导调控系统    毕业论文    随着基因治疗研究的不断深入，目的基因的精确表达已经成为首要问题。由于解决上述问题最好的方法就是拥有1系列复杂严密的基因调控系统，所以研究者们1直在寻求1种高效可靠的诱导调控体系，而RU486诱导调控系统就是目前找到的较好的1种。近10年来这1系统的研究已很广泛，它的结构也有几次大的改进，现就此予以综述。 1 RU486调控系统的结构 1 RU486调控系统的基本结构 RU486调控系统是1994年被Wang等1提出的，它由嵌合调控子反式

2、作用调控区和目的基因区两部分组成。反式作用调控区含有任意启动子控制下的嵌合调控子（chimeric regulator, GLVP），后者是1种嵌合型的可诱导转录因子，它包括酵母转录因子Gal4的DNA结合区（Gal4DBD）、单纯疱疹病毒蛋白VP16激活区（VP16AD）和PR-891突变体改良后的C末端配体结合区（PRLBD-891）3部分。目的基因区是指在最小启动子（TATA盒或胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子tk）和4个Gal4 DNA结合区串联体（p17×4）调控下的目的基因，如图1。在GLVP中，Gal4DBD 代替了孕酮受体的DNA结合区，从而避免了任何激活内源性孕酮敏感性基

3、因的可能，并且由于GAL4 DBD在哺乳动物细胞中不存在，目前也没有发现任何哺乳动物的靶基因可以被Gal4激活，所以这1调控子只会调控目的基因的表达，而不会影响任何内源基因1。PR-891是指野生型孕酮受体在891位点平头切断造成的突变体，因此其不能与孕酮受体激活剂R5020结合，但却可以与抗孕酮片RU486结合，从而在RU486存在时激活孕酮受体介导的基因。这可能是由于PR-891比野生型受体少42个氨基酸，而孕酮结合位点属于缺失的下游内，RU486结合区则位于上游位置2。这就避免了给予RU486时，激活内源性孕酮受体诱导其它基因引起1系列的细胞反应。并且由于反式作用调控子是1种嵌合型的可诱

4、导转录因子，所以它不再与孕酮反应元件（PREs）或糖皮质类固醇应答成分（GREs）结合3，干预孕酮受体介导的转录，取而代之的是在RU486作用下，这1调控子仅仅与目的基因区的Gal4DBD结合，并激活目的基因转录表达2。由于PRLBD-891的转活能力较差，而VP16AD，即VP16的 C末端为酸性，可以直接与转录起始复合物中的转录因子TFIIB、TATA结合蛋白（TBP）和TBP辅助因子TAFII40相互作用，具有很强的转活功能。 在目的基因区内，启动子有两种：胸腺嘧啶脱氧核苷激酶启动子（tk）和腺病毒E1b基因中仅仅包含TATA盒的最小启动子。Tsai2等使用氯霉素乙酰转移酶（CAT）作报

5、告基因对2者进行比较发现，p17x4-TATA-CAT比p17x4-tk-CAT转染时CAT基础活力明显要低1些；而给予RU486后，前者的CAT效能可达大约50倍，后者仅有1015倍。这可能是由于tk启动子中含有GC和CAAT盒等序列，从而使转录效能较大。所以TATA盒启动子结构应用于要求目的基因的基础表达很低时，而在基础活力稍高能够耐受，要求转录效能很大时应使用tk启动子结构。对于p17x4，Gal4 DNA结合区的4个串联体则在这1系统中可以提供最大的转录效能。 2 RU486调控系统的结构改进 为了使RU486调控系统将来能够应用于人类的基因治疗，降低细胞毒性和免疫原性，Mark等41

6、999年使用NFB家族成员人的p65激活区（286550）替代VP16激活区，构建出新的RU486反式作用调控区（GLP65），以减少VP16激活区可能带来的免疫反应。他们发现使用TATA盒启动子启动目的基因时，在没有RU486的情况下，GLP65的基础活力明显低于GLVP；给予RU486后两个调控子均表现出配体剂量依赖性的目的基因表达，这时GLVP组目的基因的表达更多，不过由于GLP65的基础值很低，所以RU486给予时，目的基因的表达倍数会更高。tk做目的基因启动子时，上述两种RU486系统则不管是否给予配体，两者的作用相当。所以在使用GLP65时，最好选用TATA盒启动子作为目的基因的启

7、动子。 另外，Mark等4在反式调控区与目的基因区之间插入小鸡-球蛋白5端区域作为绝缘子（INS）将2者分隔，使目的基因在没有RU486的情况下不受调控系统的调节而产生表达。但是他们发现在活体大鼠模型，没有RU486表达，有无绝缘子都不会有目的基因的表达；但是HELA细胞水平上，不含绝缘子者的目的基因则会有较少的表达，而含绝缘子者没有。    2 RU486调控系统的激活 RU486调控系统的激活过程与甾体类激素被其配体激活相似。反式作用调控子可以在不同的组织定向启动子作用下，在各自靶向的组织或细胞进行表达。当存在RU486时， RU486与PRLBD-

8、891相结合，促使反式作用调控子发生构象变化形成2聚体而激活，激活的反式作用调控子与目的基因上游的Gal4 DNA结合区4聚体结合，从而启动目的基因的表达，如图2。反之，在没有RU486的情况下，由于反式作用调控子的构象不会发生变化，所以RU486调控系统不能被激活，即目的基因不能转录表达。这样，RU486调控系统便可根据RU486的量及给予时间，对目的基因的表达水平及其表达时程的长短进行控制2。 图2 RU486调控系统激活示意图3 RU486调控系统的特点 1. 调控子的激活依赖于RU486的给予。在没有RU486的情况下，调控子所表达的蛋白没有毒性，也不传递表型，调控子不能激活目的基因的

9、表达。只有给予RU486激活调控子后，目的基因才会表达蛋白。 2. RU486调控系统在转录水平调控目的基因的表达，所以可以直接控制后者的表达。 3. RU486给予量很小，仅仅能够激活调控子，并不能抑制内源性孕酮受体或糖皮质激素受体的功能。众所周知，RU486作为孕酮和糖皮质激素的拮抗剂时，它的浓度范围须达微克分子级，所以在临床使用中RU486作为流产药物的剂量应达600mg或10mg/kg。然而，在RU486调控系统中的RU486只需很少的浓度就可使目的基因表达。Wang等曾做RU486的浓度对照实验发现，当RU486浓度仅有0.1nmol/l时即可诱导目的基因的表达，并且系统达到最大活力

10、时的浓度也仅须1nmol/l，这1剂量要比产生内源拮抗作用的浓度低1000倍1。 4. 调控过程是可逆的，且其使目的基因大量表达。RU486停药后目的基因表达停止，RU486的重复给予也会重复诱导目的基因的表达。 5. RU486调控系统非常适用于中枢神经系统的基因治疗。因为服用RU486后，其很容易通过血脑屏障，在临床中可以安全使用。 4 RU486调控系统的应用 1 RU486调控系统在单纯疱疹病毒载体（HSV）中的调控 Oligino5等将RU486系统引入无复制能力HSV载体中，lacZ为目的基因的目的基因区（p17x5-TATA-lacZ）插入HSV的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶位点，反式作

11、用调控区（VP-GL）置入同1载体的糖蛋白C位点，构建成HSV重组病毒GVHLZ。在病毒转染Vero细胞24h后，他们发现如果不给RU486，lacZ表达很低；若将细胞培养在含10-7mol/L的RU486基质中时，lacZ就会大量表达。并且，107mol/L的RU486即可使目的基因表达达最大。将GVHLZ注入SD大鼠海马后12和36h，给予RU486或生理盐水作对照，48h后处死大鼠取出海马进行检测，Oligino发现lacZ表达比对照组高达150倍。 2 RU486调控系统在腺病毒载体（Ad）中的调控 Magnus等6首次将RU486系统引入重组腺病毒载体中，CAT作为报告基因与p17x5-TATA结合插入Ad中形成AdG5TripCAT，反式作用调控区插入Ad形成Ad5dl309，将两者共转染HeLa细胞。他们在转染开始给予RU486后16h用ELISA法检测CAT的表达，发现CAT的表达随RU486给予量增加而逐渐增大，当RU486达4umol/l时CAT达最大。 2004年，钱程7等成功构建出RU486调控并携带IL12的第3代腺病毒，并将其进行了体外及体内的实验验证，发现RU486可以诱导和调控IL12的表达，这种诱导呈剂量依赖性变化，并且在调整RU486的给药间隔和重复给药，IL12的表达也会随其波动