绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达分子实验设计

1、.绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵彭千一、质粒转化入感受态细胞并培养1、 原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖， 制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中， 使其繁殖，就能获得大量质粒。所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA 而不将其降解的生理状态。感受态形成后，细胞生理状态会发生改变， 出现各种蛋白质和酶， 负责供体 DNA 的结合和加工等。细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。 本实验为了把外源 DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收

2、外来 DNA 分子的感受态细胞。2、 实验步骤2.1 DH-5 和 BL-21感受态细胞的制备（ 1）将 04 保存的 DH-5 和 BL-21菌种分别接种在 LB液体培养基中 37 下 250 r/min 过夜培养 16 h 。（ 2） 将分别接种过夜菌： LB 按 1:50 的比例接种于 2 mL 的 LB 液体培养基中，37 活化培养 23 h 至 OD=0.30.5 。（ 3） 取 1.5 mL 菌液转入 EP管中，置于冰上 10 min, 然后于 4 下 5000 r/min离心 5 min。弃上清液，沉淀加入 0.1 mL 预冷的 0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。冰上放置

3、15-30 min 后， 4 下 5000 r/min 离心 10 min。（ 4） 弃上清液，沉淀用 0.1 mL预冷的 0.1 mol/L CaCl2（含 15%甘油）缓和悬菌，放在 20 冰箱内保存。2.2 感受态细胞的转化（ 1） 取制备好的感受态细胞100 l，冰上解冻，均匀悬浮。（ 2） 加入 2 l 酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。（ 3） 42 水浴中热击 70 sec 后，冰上放置 2 min。（ 4） 加入 200 l LB液体培养基， 37 ， 50-100 rpm 振荡培养 1 h。（ 5） 取 200 l 悬浮细胞涂布在含合适抗生素的 LB 固体培养基

4、上，用涂布器均匀涂布，平皿正放静置 1-2 h 后，封口膜封好平皿， 37 培养倒置 12-16 h。二、 质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测1、 原理：首先选择好将绿色荧光蛋白导入大肠杆菌的载体，一般选用 pET-28a 质粒，因为该质粒具有多酶切割位点，并且导入外源基因后可以充分表达。已知pEGFP-N3 质粒上携带表达绿色荧光蛋白的基因，此基因作为目的基因 pET-28a 质粒作为载体进行重组前需要先提取并检测。使用 碱 裂 解 法提 取 质粒 ， 用 到3种溶 液， 溶 液I ： 50 mM葡 萄糖、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA ，pH 8.0；溶液 II ：0.

5、2 N NaOH、1% SDS；溶液 III ：3 M 醋酸钾、 2 M 醋酸。选用适当浓度和适当 pH 值的 Tris-Cl 溶液来调节溶液 ph。加入的葡萄糖可以使悬浮后的菌不会快速沉积到管子底部。 EDTA;.是 Ca2+和 Mg2+ 等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase 的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。溶液II中 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，会使细胞膜从双层膜向微囊结构的相变化， SDS 为下一步做铺垫。溶液 III 的作用 SDS 在高盐浓度下发生沉淀，同时 SDS 能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，所以

6、沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。 溶液中的 K+ 置换了 SDS 中的 Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组 DNA 很长，容易被 PDS 共沉淀。 2 M 的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA 。基因组 DNA 一旦发生断裂，小于 100 kb 的片断，就不容易与 PDS 共沉淀。所以碱处理的时间要短， 而且不得激烈振荡， 否则最后得到的质粒上会有大量的基因组 DNA 污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使 PDS 沉淀更充分。在 pH 为 8.0-8.3 时，核酸分子碱基几乎不解离， 磷酸全部解离， 核酸分子带负电，在电泳时

7、向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛作用下， 事分子大小和构象不同的核酸分子涌动率出现较大的差异， 从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 核酸分子中嵌入荧光染料 （如溴化乙锭）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 在质粒提取的过程中， 由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性 DNA 、开环 DNA 、闭环超螺旋 DNA 。当提取的质粒 DNA 电泳时，同一质粒 DNA 泳动速度：闭环超螺旋线状开环。2、 实验步骤2.1 将目的基因质粒的大菌种接种在液体培养基中（相应浓度抗生素） ， 37培养过夜。2.2 收集菌体将扩增的菌体收集 1.5mlEP.管中。每次

8、 4， 12000r/min 离心 2min，弃上清液后重复一次，弃上清液。2.3 裂解菌体（ 1）将菌体沉淀重悬于100 l 用冰预冷的溶液中，剧烈振荡10min.（ 2）加 200l 新配制的溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管 5 次，以混合内溶物，不可强烈振荡，放置冰上 5min 左右。（ 3）加 150 l 用冰预冷的溶液，盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10s，使溶液在粘稠的细菌裂解物分散均匀，置冰上15min。（ 4） 4、 10000r/min 离心 5min，将上清液转移到另一离心管中，并定量上清液的体积。2.4 提取质粒 DNA（ 1）加等体积酚：氯仿（ 1： 1），于上清夜中，振

9、荡混合， 4、 10000r/min，离心 10min，将上清液转移到另一离心管中，冰定量上清液的体积。（ 2）加 2 倍体积的无水乙醇和 0.1 体积的 3mol/L NaAc ，室温下沉淀质粒 DNA ，振荡混合，放置 30min。（ 3） 4、 12000r/min 离心 30min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。（ 4） 用冰冷的 1ml70%乙醇洗涤质粒 DNA 沉淀 2 次（每次用），不要搅起沉淀，弃上清、倒置于滤纸上，使沉淀干燥。（ 5） 保存质粒 取适量 TE 缓冲液溶解质粒 DNA ，混匀后 -20保存备用。2.5 DNA

10、 琼脂糖凝胶电泳的检测（ 1）装好制胶装置 用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好(一定封严，不能留;.缝隙 ),使用水平仪，将胶板调至水平，插入适当梳子。（ 2）将 1g 琼脂糖加入 30ml 1×TAE 电泳缓冲液中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到 60，加入 1 l 的 Goldview ，并摇匀），则为 1琼脂糖凝胶液。（ 3）将溶解的琼脂糖（约 50）倒入，室温冷却凝固。（ 4）充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中 (注意：DNA 样品孔应朝向负电极一端 )，加 1×TAE 电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1mm。（ 5）用移液器

11、吸取质粒样品 5l 于封口膜上，再加入 1 l 的 6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。（ 6）打开电源开关，调节电压至 100V，可见蓝条带由负极向正极移动。（ 7）当蓝条带移动到距凝胶前沿 1 2cm 处，停止电泳（ 8）将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯， DNA 存在处显出荧光条带。三、 PCR、酶切等方法获取目的基因，酶切连接重组质粒1、原理PCR 是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶 DNA 两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的 DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环， 然后反复进行， 使目的的 DNA 得以迅速扩增。置

12、待扩增 DNA 于高温下解链成为单链 DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA 聚合酶在 72将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'3'方向延伸，合成DNA 新链。目的基因与载体扩增后要进行重组， 利用共有的酶切位点即Bam Hl 和 Not I两个位点进行双酶切，产生相同的粘性末端便于在DNA 连接酶的作用下重新连接。2、实验步骤2.1 PCR 实验（ 1）在 0.2ml EP 管内配置 PCR 反应体系一个。（ 2）混匀后瞬时离心。（ 3）放入 PCR 仪中，设置反应程序。2.2 酶切实验（ 1）分别取两支

13、0.2ml EP 管做好标记。（ 2）两个 EP 管中分别配置两个体系即各加入一种质粒和两种限制性内切酶。（ 3）将两支 EP 管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱 37酶切 1h。（ 4）可取 5l 进行电泳检测。2.3 DNA 的连接重组（ 1）在 EP 管中加入缓冲液，酶切后的载体质粒和荧光蛋白质粒以及DNA 连接酶。（ 2） EP 管中液体混匀后瞬时离心，放入培养箱22反应 20min， -20下保存用于转化。四、重组质粒导入 DH5 扩增1、原理重组质粒虽已构建完毕， 但是为得到大量的重组质粒， 需要将重组质粒导入到 DH5 中进行扩增。为了将重组质粒导入细菌中， 我们首先得使得细菌处于

14、易于吸收外源 DNA 得感受态。其原理是细菌处于 0，在有 CaCl2存在的低渗溶液;.中，菌细胞便会膨胀成球形，易于吸收外源 DNA。再加之转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 -钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热击处理，促进细胞吸收 DNA 复合物。在将重组质粒导入细菌之后， 就需要将细菌置于非选择性培养基上培养一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达。 然后，再将培养的到的细胞转接到含有 Kana的 LB 固体培养基上，便可以鉴定和筛选出重组子。2、实验步骤（ 1）取出感受态细胞 DH5让其在冰上自然解冻，每 200l 解冻的感受态细胞加入整管连接产物，混匀

15、后冰浴 30 min。（ 2） 42热冲击 90 秒，立即置于冰浴 5min。（ 3）再在感受态细胞混合物中加入 0.8ml 的 LB 培养基，于 37的摇床中培养1h。（ 4）1h 后，6000r/min 离心 3min，去掉上清液（约留 200l 的培养液），摇匀菌快。（ 5）用玻璃涂布器将溶液均匀地涂布在含 Kana 的 LB 固体培养基上，正置培养皿半小时后， 37倒置培养皿过夜。（ 6）第二天早晨，观察实验结果。五、菌落 PCR 鉴定阳性克隆1、 原理菌落 PCR可不必提取目的基因 DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的 DNA 为模板进行 PCR扩增，省时少力。在实验过程

16、中，我们特意使用载体上的通用引物来筛选阳性克隆。2、 实验步骤（ 1 ）在 0.2ml 的 EP 管内配制 25lPCR 反应体系一个： 18.5 lddH2O，2.5l10*Buffer ， 1.5lMgCl2，1l4*dNTP，0.5l 的引物 1， 0.5l 的引物 2，0.5l的 Taq酶，挑菌落一个。（ 2）用灭菌枪头挑单菌落接触 EP 管内，混匀瞬时离心。（ 3）放入 PCR 仪中，设置反应程序： 94 预变性 5min ； 94变性 30s ； 55退火 30s ； 72 延伸 60s ；重复 30 次； 72延伸 10min 。（ 4）取 9l 反应液加 1l10*Loading Buffer 做电泳检测。六、pET-28a-EGFP 的表达1、 原理于重组质粒导入 DH5扩增步骤的原理相同， 首先得到感受态细胞， 然后将 pET-28a-EGFP 质粒导入其中，在培养基上培养，使其表达。2、 实验步骤（ 1）取出感受态细胞 BL21 ，让其在冰上自由解冻， 5lpET-28a-EGFP 质粒加入 200 l 解冻的感受态细胞中，轻弹混匀后冰浴 30min。（