光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响(1)

1、    光气吸入对大鼠肺组织基因表达谱的影响(1)    】 目的： 研究光气吸入染毒前后大鼠肺组织基因表达的差异，探讨光气肺损伤作用相关的基因谱. 方法： 提取正常对照组和光气染毒组肺组织的总RNA，并以此为模板制备荧光标记的cRNA靶物，经杂交、洗涤后，通过扫描荧光强度和计算机软件分析，寻找染毒前后上调和下调的差异表达基因. 结果： 在大鼠20500个靶基因中，初步筛选出801条差异表达基因，表达上调的有557条，下调的有254条. 根据基因的生物学功能，差异表达基因被分为9类：G1自由基电子传递相关；G2 应

2、激炎症相关；G3 物质代谢相关；G4 细胞增殖分化凋亡相关；G5 基因表达调控相关；G6 受体和信号转导相关；G7 蛋白质修饰分解相关；G8 细胞骨架运动相关；G9 离子通道与物质转运相关等. 结论：光气可以引起肺组织基因的多发性改变，其差异表达基因的功能分类为进一步探讨光气中毒发生、发展的机制和有效救治提供新的线索和思路. 【关键词】 光气；肺/损伤；寡核苷酸序列分析；基因表达光气（phosgene,COCl2）又称碳酰氯，属于高毒类窒息性毒剂，是合成化工产品的重原料，广泛用于涂料、农药、塑料和纺织品等生产领域，由于挥发温度低（8.2）、分散度高、反应快速，而被认为是具有高度潜在危险的恐怖武

3、器1-2. 光气的主毒性作用是对呼吸系统的损害，引发肺水肿3，但其中毒机制截至目前尚未完全阐明，临床治疗亦无特效措施4-5. 我们利用基因芯片技术，探讨光气染毒后大鼠肺组织基因表达谱的改变以及差异表达基因与肺损伤的关系，旨在从新的角度对光气中毒机制进行阐述.1材料和方法SD大鼠10只，雌雄各半，体质量145 g 170 g,（第四军医大学实验动物中心）；TRIzol Reagent （美国Invitrogen公司）；cRNA扩增与标记试剂盒（Lifegen公司）；RNA纯化试剂盒（荷兰Qiagen公司）；芯片杂交试剂盒（美国Agilent公司）；杂交箱（美国UVP公司，HL2000型）；芯片扫

4、描仪（美国Axon公司，4000B型）；凝胶成像系统（美国UVP公司，G800型）.将大鼠随机分为对照组和染毒组，每组5只. 正常组未在光气中暴露，染毒组给予光气染毒（38 mg/L， 1 min）. 4 h后分别将两组动物按20 mg/Kg 用10 g/L戊巴比妥钠麻醉，充分暴露胸腔，左心房开放后经右心室沿肺动脉注入无RNA酶的水对肺组织进行灌洗以尽量排尽血液，最后在肺的同一部位剪取肺组织，经TRIzol处理，迅速置于液氮中保存.标记用RIzol试剂一步法抽提细胞总RNA，并用甲醛凝胶电泳，检测总RNA样本的质量；用紫外分光光度计，分别在260 nm，280 nm处检测cRNA的产量和纯度.

5、 用cRNA扩增与标记试剂盒对靶物进行Cy3或Cy5荧光标记，用RNA纯化试剂盒对标记靶物进行纯化，分别在550 nm，650 nm处检测Cy3和Cy5的荧光强度，以评估荧光标记效率.芯片探针长度60 mer，共包括22575个样点，其中覆盖大鼠基因20 500个，positive control探针913个，negative control探针162个，空白探针1000个. 按照芯片杂交试剂盒提供的操作标准，将芯片和cRNA荧光标记靶物进行杂交. 经洗涤后，室温500 r/min离心10 min，甩干芯片表面液体，取出后立即进行扫描.将清洗甩干的芯片置于Axon 4000B型扫描仪中，用Ge

6、nepix3.0软件进行图像扫描，得到芯片杂交图谱，读取每个样点的原始荧光信号数据，并对读取的数据用Spotfire 8.0软件进行分析，经归一化处理后，制作基因差异表达分析散点图. 导出上调基因和下调基因列表. 判断基因差异表达的标准：当R2时表示基因上调；R0.5时表示基因下调；当0.5<R<2时则认为基因无差异表达.< p>    对符合基因差异上调或下调表达标准的单个基因，通过连接基因库权威网站：和，进行基因功能比对和分类，制作光气染毒后肺组织

7、的差异表达基因图谱.2结果RNA甲醛凝胶电泳显示，28 s，18 s两条带清晰完整，证实提取的RNA无降解（图1）. 经紫外分光光度计分析，A260 nm/A280 nm值均为2.0，说明制备的RNA纯度较高，符合实验求.以效率大于8 mol/g视为标记有效，计算得荧光标记效率分别为9.81 mol/g和9.04 mol/g，符合参加杂交反应的条件.    经对双色荧光标记杂交扫描图谱和基因表达分析散点图进行基因差异表达分析，在大鼠20 500个靶基因中，染毒组相对于对照组上调的基因有557条，其中已知基因433条，未知基因124条；下调的基因有254条

8、，其中已知基因205条，未知基因49条. 部分显著变化的基因（表1）. 表1光气染毒后肺组织的部分差异表达基因（略）经基因生物学功能分析，将差异表达基因分为9类，其功能已知基因分类结果显示，光气染毒后细胞的能量生成下降，包括：参与糖有氧代谢的基因表达下调，如NM033235，编码苹果酸脱氢酶1；而参与糖异生和糖无氧酵解的基因表达上调，如BI277389，编码磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1. 与能量水平密切相关的部分功能基因也表达异常，如NM053578基因下调，编码ATP酶H 转运溶酶体9kDaV0亚基e，参与ATP合成偶联的质子运输；NM022235基因上调，编码钾电压阀门通道Isk相关家族成员3，

9、参与K离子转运等（表2）. 表2差异表达基因的分类及数目（略）3讨论近年来，光气作为重的化工原料，在生产、运输、使用等过程中，对人员和环境造成了严重危害6. 光气吸入中毒最显着的临床表现是肺水肿的形成，也是中毒人员致死的主原因. 我们利用基因芯片技术，对光气染毒前后的基因表达谱进行了分析. 从差异基因数量来看，差异表达在两倍以上的基因达801条，占靶基因总数的3.9%，说明光气可以引起肺组织基因的多发性改变，证实了光气致肺水肿的发生、发展是一个多基因调控的过程7，提示在正常肺组织细胞中可能存在着相当数量的基因容易受到有毒化学物的作用而发生改变，其基因表达是一个复杂而又不稳定的生物学过程，有人称

10、之为“不稳定型基因组”8. 表1所列出的部分变化显著的功能基因可能是光气毒性作用的敏感基因或靶标基因.            【摘】目的： 研究光气吸入染毒前后大鼠肺组织基因表达的差异，探讨光气肺损伤作用相关的基因谱. 方法： 提取         本篇论文是由3COME文档频道的网友为您在网络上收集整理饼投稿至本站的，论文版权属原作者，请不用于商业用途或者抄袭，仅供参考学习之用，否者后果自负，如

11、果此文侵犯您的合法权益，请联系我们。从差异基因功能来看，很大一部分差异表达基因与细胞的基本生理功能有关，说明此类基因参与的生物过程比较复杂. 测定结果和统计分析也表明，与自由基、电子传递相关的基因，虽然其差异表达基因的数量较少，但秦绪军等9的报道，自由基损伤在光气中毒过程中起着重作用. 我们的结果显示，上调的BF556648编码金属硫蛋白1和金属硫蛋白2，通过与金属离子结合，参与电子传递，发挥抗氧化剂作用10；下调的NM012611编码诱生型一氧化氮合成酶，参与NO生物合成，NO作为体内十分活跃的自由基分子，与分子氧、超氧阴离子及一些金属离子发生反应，可引起广泛的自由基损伤11. 此结果从基因

12、水平表明自由基确实在光气中毒过程中扮演着重角色，当光气引发自由基产生时，机体通过自身代偿，在一定程度上减轻了自由基的损伤作用. 同时也提示我们，利用复合抗氧化剂进行光气吸入后的早期治疗，可能会有效地提高救治效果.经对差异表达基因进行系统分析，我们认为光气中毒可能存在如下机制：光气吸入肺组织以后，在发生即时性理化损伤作用的同时也引起了肺组织“不稳定基因”的差异表达，其中与自由基、电子传递相关的基因，首先引起生物电化学平衡的紊乱，可能是引起肺组织延时性损伤的起始动因；受之影响，与物质代谢、细胞分裂、基因表达及信号转导相关的基因相继也发生改变，进而导致细胞基本生理功能障碍，其中能量代谢水平的异常，可

13、能是引起细胞其它功能障碍的最根本原因；最后，当损伤积累到一定程度，细胞失去代偿能力，细胞正常结构受损，离子通道及物质转运失调，可能是各类细胞损伤的最终结果，也是引发肺水肿的直接原因.【参考文献】1Burklow TR, Yu CE, Madsen JM. Industrial chemicals: Terrorist weapons of opportunityJ. Pediatric Annals, 2003,32(4): 230-234.2Evison D, Hinsley D, Rice P. Chemical weaponsJ. BMJ, 2002,324(7333):332-335.

14、3Sciuto AM, Moran TS, Narula A, et al. Disruption of gas exchange in mice after exposure to the chemical threat agent phosgeneJ. Mil Med, 2001,166(9):809-814.4Borak J, Diller WF. Phosgene exposure: Mechanisms of injury and treatment strategiesJ. J Occup Environ Med, 2001,43(2):110-119.5徐兰萍. 光气中毒机制与治疗进展J. 职业卫生与应急救援,2005,23(4) :183-185. 6陈玉熹, 陈红辉, 陈之力, 等. 急性光气中毒19例J. 临床医学,2006,26(12) :12-13.7张晓迪, 海春旭, 秦绪军, 等. 光气致急性肺损伤下调差异基因的初步筛选J. 卫生毒理学杂志,2004,18(03) :165-166.8孟紫强, 秦国华, 白巨利, 等. SO2对大鼠肺基因组表达谱的影响环境表达不稳定基因组存在的证据J. 山西大学学报(自然科