人参皂苷单体Rh2诱导小鼠前胃癌细胞系凋亡的分子机制

1、人参皂苷单体Rh2诱导小鼠前胃癌细胞系凋亡的分子机制吴歌,杨世杰吴歌.杨世杰,吉林大学基础医学院药理学教研室吉林省长春市130021吴歌在读博士研究生主要从事肿瘤分子药理学的研究通讯作者:杨世杰 130021 吉林省长春市吉林大学基础医学院药理教研室.jcyaolisina com电诂:0431-*收稿日期:2007061 4 修回日期:20070924Molecular m echanism of G-Rh2-induced apoptosis in gastriccarcinom a cellsGeWu,Shi-.1ieYangGe Wu,ShiJie Yang,Department of

2、 Pharmacology,School of Basic Medical Sciences.Jilin University,Changchun 1 3002 1,Jilin Province,ChinaCorrespondence to:ShiJie Yang.Department of PharmacologY,School of Basic M edical Sciences.Jilin University. Changchun I 3002 1,Jilin Province.China.jcyaoliReceived:2007.06.14 Revised:2007.09.24 Ab

3、stractAI M:To investigate the effect of Ginseng(G. Rh2 on the proliferation and apoptosis of mousegastric carcinoma cells(MFCs,and to explorethe activation of the Ca transduction pathwaysmediating G.Rh2-induced M FC cell apoptosis.METHODS:M FCs were divided into a norm alfreeserum MFC cell group,a G

4、Rh2 f3,10,30mg/Ltreatment group,a Ca chelator BAPTA(20tmo1+GRh2(10 mg/Lgroup and a BAPTA(20tmo1group.Morphologic changes wereobserved by fluorescence microscopy(Hoechst33 2581.The early apoptosis rate was detectedby Annexin V.FITC using flow cytometry;lateapoptosis was analyzed by agarose gel electr

5、ophoresis.The m itochondrial m em brane poten.tial fAWm1 and Ca densitv were measured byconfocal m icroscopy.The expression of caspase3 was observed by W estern blotting.RESULTS:GRh2(10 mg/Lreinforced cell ac。tivity and induced apoptosis of M FC cells.Theapoptosis rate in the drug gr oup increased g

6、r eat。ly after GRh2 treatm ent.GRh2 induced M FCcell apoptosis,m arkedly enhance calcium ion concentration,effectively reduced AWm an d increased the protein expression of caspase 3,butal1 of these effects could be inhibited by BAPTA (20tmo1.CONC LUSION:GRh2 can induce apoptosis ofgastric carcinoma

7、cells,possibly via a Ca dependent mi tochondrial apoptosis pathway.Key Words:Ginseng Rh2;Apoptosis;Gastric carcinoma;Flow cytometw;Western blottingWu G,Yang SI.Molecular mechanism of GRh2-induced apoptosis in gastric carcinoma cells.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2007;15(28:29722976摘要目的:观察人参皂苷Rh (G.Rh

8、诱导小鼠前胃癌MFc细胞的凋亡,探讨ca 在G.Rh 诱导细胞凋亡中的作用,揭示G.Rh 诱导MFC细胞凋亡的分子机制.方法:分别对无血清培养24 h后的MFCf-常细胞组、G.Rh,f3、10、30 mg/L给药组、Ca 螯合剂BAPTA(20 Bmo1+G.Rh,(1 0 mg/L给药组及BAPTA(20tmo1组,荧光显微镜(Hoechst 33 258察细胞形态学改变;流式细胞仪Annexin V-FITC双染法检测细胞早期凋亡率琼脂糖凝胶电泳法观察细胞晚期凋亡;共聚焦显微镜分析G.Rh,给药后细胞内钙和细胞线粒体膜电位,Western blot分析caspase 3的表达.结果:10

9、 mg/LG.Rh 能显著抑制无血清培养的MFC细胞增殖和诱导MFC细胞凋亡,可剂量和时间依赖性的提高细胞内钙浓度,降低细胞线粒体膜电位,增caspase 3的表达,但这些作用均 BAPTA(20tmo1抑制.结论:G.Rh 可激活细胞内Ca 信号转导途径,从而最终通过线粒体凋亡途径诱导胃癌细胞凋亡.关键词:人参皂苷单体R h2;凋亡;胃癌;流式细胞仪;免疫印迹0引言人参皂苷单体Rh2(ginsenoside Rh2是从人参中分离出的原人参二醇型低糖链皂苷单体,多项研究证实,G.Rh 可以通过诱导细胞调亡或分化有效地抑制多种肿瘤细胞D-7的增殖活性,而目前尚无其对胃癌增殖抑制的研究报道.目前已

10、揭示的参与GRh,诱导凋亡的信号分子包括JNK【8、Cdk2 ,PKC8 m 等,然而G.Rh2上调这些蛋白酶活性的分子机制仍不明晰.2006年,Hamct af11首次发现GRh,可使HeLa细胞线粒体的Ca外升高,随之产生大量ROS,进而激活JNK途径,并最终通过线粒体凋亡通路诱导MFC细胞凋亡.本研究以小鼠前胃癌MFC细胞为受试细胞,探讨G.Rh 在诱导胃癌细胞凋亡过程中Ca抖信号转导途径的激活及下游线粒体凋亡通路活化的分子机制.1材料和方法1.1材料GRh 由吉林大学分析化学教研室提供, IMDM培养基购自美国Gibco公司,新生小牛血清购自杭州四季清生物有限公司,Hoechst 33

11、258购自凯基生物,Annexin V-FITC试剂盒购自晶美生物工程有限公司。动物细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒购自北京鼎国生物公司,Rhodamine123购Sigma公司,Fluo一3,AM购自Molecular Probes 公司,caspase 3购白天津灏阳,BAPTA购自北京海德生物.12方法MFC细胞由本室冻存,常复苏后,培养和维持在体积分数为100 mL/L新生小牛血清IMDM培养液里,置CO2培养箱(37"C,50 mL/LCO 培养,取对数生长期细胞经24 h无血清培养后。分组进行实验.1.2.1分组及细胞处理对数生长期的MFC细胞经24 h无血清培养后

12、,将密度为1.0X 10 /L的MFC细胞分为:空白对照组、GRh 各组(3、10、30 mg/L。检测早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率:将MFC细胞分为:空白组、G.Rh (10mg/L组、GRh2(10 mg/L+BAPTA(20 i.tmo1组、BAPTA(20 I.tmo1组,检测细胞核形态,线粒体膜电位,细胞内钙各项实验指标.1.2,2流式细胞仪分析收获细胞,用4"C预冷的PBS洗两次,用250 uL结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其浓度为1 x 10 /L,取100 L细胞悬液于5 mL流式管,加入5 L mexinV-FITC(150mg/L和10 L碘化丙锭(120 mg/

13、L,混匀后室温避光孵育15 min,在反应管中加400 laL PBS,流式细胞仪(FACS分析细胞凋亡率.1.2.3琼脂糖凝胶电泳检测晚期细胞凋亡药物处理24 h后,收集细胞,按动物细胞凋亡DNA Ladder提取试剂盒要求提取DNA,每个泳道上样量为10 L,用20 g/L琼脂糖凝胶电泳,电压为4 V/cm,经EB染色后,凝胶成像系统下观察和照相.1.2.4细胞形态学观察细胞经药物处理12 h后,在同一视觉域内用Hoechst 33258(10 mg/L进行核染色,然后在荧光显微镜(Leica Microsystems Wetzlar GmbH,Germany下观察细胞核形态并记录.1.2

14、.5共聚焦显微镜测定线粒体膜电位和细胞内钙线粒体膜电位1 2-13:收集细胞,加入0.026 mmol/L的Rhodamine123染液200 laL,37避光孵育10 min,用PBS洗3次后,每孔选4个视野,每个视野观察50个细胞,以平均荧光强度变化反映细胞线粒体膜电位的相对水平,荧光探针Rhodamine123进入细胞。其激发的荧光强度与细胞内线粒体膜电位成正比,所得荧光强度以软件处理即得激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位.细胞内钙:收集细胞,加入10 lamol/L的Fluo一3,AM负载液200 laL,37"C避光孵育40 min,用Hepe液洗涤3次后,每孔选4个视野,每个视野观察50个细胞,以平均荧光强度变化反映细胞内游离钙浓度的相对水平.荧光探针Fluo一3/AM进入细胞,其激发的荧光强度与细胞内游离钙离子的浓度成正比,所得荧光强度以软件处理