HPLC法研究还原型谷胱甘肽降解产物[1]

1、第28卷第5期2011年5月沈 阳 药 科 大 学 学 报Journa l o f Sheny ang Phar m aceutica lU nive rsit yV o l 28 N o 5M ay 2011p 350收稿日期:2010 08 30作者简介:孙宝丹(1985 ,女(汉族,吉林德惠人,硕士研究生,E m ail bao dan .g ood ;郭兴杰(1956 ,女(汉族,辽宁葫芦岛人,教授,博士,主要从事药物分析研究,T e l .024 *,E m ail gx j hy z yaho o 。文章编号:1006 2858(201105 0375 05HPLC 法研究还原型谷

2、胱甘肽降解产物孙宝丹,姜 珍,程维明,郭兴杰(沈阳药科大学药学院,辽宁沈阳110016摘要:目的研究还原型谷胱甘肽(G S H 在不同破坏条件下的降解产物;在此研究基础上,建立了氧化型谷胱甘肽(GSS G 杂质测定方法。方法采用C enturySIL AQ C 18色谱柱(4 6mm 200mm ,5 m ,50mm o l L -1磷酸二氢钾溶液(含10mm o l L -1庚烷磺酸钠,用磷酸调节p H 值至3 0 甲醇(体积比97 3为流动相;检测波长为210n m 。结果通过对比HPLC 保留时间,确定破坏样品中主要降解产物为GSS G 、二肽半胱氨酰甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和胱

3、氨酸。按外标法计算G S H 原料中G SSG 的含量为0 32%。结论建立的G SSG 测定方法结果准确,重现性好,可用于G S H 原料中G SSG 的控制。关键词:还原型谷胱甘肽;氧化型谷胱甘肽;有关物质;降解产物;高效液相色谱法中图分类号:R 917 文献标志码:A谷胱甘肽是由谷氨酸(G l u 、半胱氨酸(Cys和甘氨酸(G l y 组成的三肽1,其在体内以2种形态存在,即还原型谷胱甘肽(reduced g l u tathi one ,简称GSH 和氧化型谷胱甘肽(ox idized g l u ta th i o ne ,简称GSSG,在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘

4、肽2,它参与细胞内许多化合物、药物及激素的代谢,对内外源性毒物有很好的解毒作用3。为确保药品的安全性,必须对药物在生产、贮存及运输等环节中可能产生的有关物质进行监控。因此,作者采用H PLC 法对GSH 通过破坏试验所产生的主要降解产物进行了研究4,并建立了GSSG 杂质测定方法。1 仪器与材料高效液相色谱仪(LC 10A 高压泵、SPD 10A 紫外可见光检测器,日本岛津公司,N2000色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所。甲醇(天津康科德科技有限公司,庚烷磺酸钠(色谱纯,山东禹城中美色谱产品厂,其余试剂(分析纯,市售,重蒸水(自制。还原型谷胱甘肽对照品(GSH,中国药品生物制品检定所,批

5、号140706 200401,半胱氨酰甘氨酸(Cys G ly 、胱氨酸(Cy2、GSSG 、G l u 、Cys 及G l y 对照品(美国Sig m a 公司,GSH 原料药(辽宁日升科技发展有限公司。2 方法与结果2 1 色谱条件色谱柱:Cen t u ryS I L AQ C 18柱(4 6mm 200mm ,5 m ;流动相:50mm ol L -1磷酸二氢钾溶液(含10mm o l L -1庚烷磺酸钠,用磷酸调节p H 值至3 0 甲醇(体积比97 3;流速:1 0mL m i n -1;检测波长:210nm;柱温:室温;进样量:20 L 。理论塔板数按GSH 计不低于2000。2

6、 2 溶液的制备2 2 1 单一杂质与GSH 混合对照溶液的制备精密称取已知杂质对照品各1 5m g ,分别置于10mL 量瓶中,再分别向各量瓶中加入GSH 对照品3 0mg ,用流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。2 2 2 混合对照溶液的制备分别称取GSSG 、Cys G ly 、Cy2、Cys 及G ly 对照品各2 0m g 及GSH 对照品30 0m g ,精密称定。置于100mL 量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。2 23 GSSG 对照储备液的制备精密称取GSSG 对照品6 0m g ,置于100mL 量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀,即得。2 3 系统适用性试

7、验分别取 2 2 1 条及 2 2 2 条下混合对照溶液各20 L 注入液相色谱仪,按 2 1 条色谱条件进样分析。与单一杂质的保留时间对照确定混合对照溶液中各杂质色谱峰。图1为混合对照 品溶液色谱图。1 So l vent ;2 G ly ;3 Cy2;4 G l u ;5 Cys ;6 CysG ly ;7 G SSG;8 GS HF ig .1 HPLC ch ro m atogra m of standards sol u tion由图1可知,各杂质峰与GSH 峰分离良好。理论塔板数按GSH 计不低于2000。计算各杂质峰与GS H 峰的相对保留时间(RRT,结果见表1。Tab le

8、1 The RRT of the re l ated substances P eak N o .RRT N a m e of i m pur it y10 24So l vent 20 41G ly 30 46Cy240 52G lu 50 57Cys 61 15Cys G ly 73 80G SSG图1中,1号峰为溶剂峰,通过比较已知各杂质对照品与GSH 的相对保留时间,确定27号峰分别为甘氨酸、胱氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、半胱氨酰甘氨酸及氧化型谷胱甘肽。2 4 破坏试验2 4 1 酸破坏试验取GSH 原料药3m g ,精密称定。置10mL 量瓶中,加水2mL 溶解,加0 5m o l L

9、-1盐酸溶液2mL,室温下放置30m i n 。用饱和氢氧化钠溶液调p H 为中性,加水至刻度,摇匀,滤过,即得酸破坏供试溶液。取上述溶液20 L ,注入液相色谱仪,按 2 1 条色谱条件进样分析,色谱图见图2。由图2可知,样品经酸破坏后,与杂质对照品相对保留时间进行对比,GS H 主峰面积减少,主要分解峰为GSSG (7号,该物质在原料药中含量较低,另外还产生Cys G ly (6号、Cy2(3号、G l u (4号、G l y (2号、Cys(5号等杂质。按峰面积由大到小排列顺序为GSSG >Cys G l y >Cy2>G l u >G ly>C ys 。2

10、 G l y ;3 Cy2;4 G l u ;5 Cys ;6 Cys G ly ;7G SSG;8 GS HF i g .2 H PLC chro ma togra m of degradation p rodu cts of GSH de stroyed by acid2 4 2 碱破坏试验取GSH 原料药3m g ,精密称定。置10mL 量瓶中,加水2mL 溶解,加0 5m ol L -1氢氧化钠溶液2mL ,室温下放置30m i n 。用1m o l L -1盐酸溶液调p H 为中性,加水至刻度,摇匀,滤过,即得碱破坏供试溶液。取上述溶液20 L ,注入液相色谱仪,按 2 1 条色谱条

11、件进样分析。色谱图见图3。由图3可知,与杂质对照品相对保留时间进行对比,碱破坏除未产生G lu 峰,其余杂质峰与酸破坏相同。峰面积由大到小排列顺序为GSSG >Cys G ly>G ly>Cys>Cy2 。2 G l y ;3 Cy2;5 Cys ;6 Cy s G l y ;7 GSS G;8 GS H F i g .3 H PLC chro ma togra m of degradation p rodu cts of GSH de stroyed by a l kali2 43 氧化破坏试验取GSH 原料药3m g ,精密称定。置10mL 量瓶中,加水4mL 溶解

12、,加质量分数为1%的过氧化氢溶液1mL,室温下放置30m i n 。加水至刻度,摇匀,滤过,即得氧化破坏供试溶液。取上述376沈 阳 药 科 大 学 学 报第28卷溶液20 L ,注入液相色谱仪,按 2 1 条色谱条件进样分析。色谱图见图4。由图4可知,氧化破坏产生4个降解产物峰,峰面积由大到小顺序为GSSG >Cys G ly >Cy2>G l y 。2 G ly ;3 Cy2;6 Cys G l y ;7 G SSG;8 GS H F i g .4 H PLC chro matogra m of degradation p rodu cts of G SH destroy

13、ed by H 2O 22 4 4 光照破坏试验取GSH 原料药3m g ,精密称定。置10mL 量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,置(4500 500l x 照度下照射10d ,滤过,即得光照破坏供试溶液。取上述溶液20 L ,注入液相色谱仪,按 2 1 条色谱条件进样分析。色谱图见图5。由图5可知,光照破坏产生3个降解产物峰,峰面积由大到小顺序为GSSG >Cy2>Cys G ly 。3 Cy2;6 Cys G ly ;7 GSS G;8 G S HF i g .5 H PLC chro matogra m of degradation p rodu cts ofG SH d

14、estroyed by li gh t2 4 5 高温破坏试验取原料药适量置于干燥的称量瓶中,于160 条件下加热1h 。精密称取30m g ,置于100mL 量瓶中,加水至刻度,摇匀,滤过,即得高温破坏供试溶液。取上述溶液20 L ,注入液相色谱仪,按 2 1 条色谱条件进样分析。色谱图见图6。由图6可知,高温破坏产生的杂质峰主要为Cy2和GSSG 。3 Cy2;7 G SSG;8 GS HF i g .6 H PLC chro ma togra m of degradation p rodu cts of GSH de stroyed at 1602 4 6 高湿破坏试验取原料药适量置于干

15、燥的称量瓶中,在恒湿密闭容器中,于25 、相对湿度为(90 5%条件下放置10d 。精密称取30m g ,置于100mL 量瓶中,加水至刻度,摇匀,滤过,即得高湿破坏供试溶液。取上述溶液20 L ,注入液相色谱仪,按 2 1 条色谱条件进样分析。色谱图见图7。由图7可知,同大多数破坏结果相同,高湿破坏也产生较大的GSSG 杂质峰。杂质峰面积由大到小顺序为GSSG>Cys G ly>Cy2 。3 C y2;6 Cys G ly ;7 GSS G;8 G S HF i g .7 H PLC chro ma togra m of degradation p rodu cts ofGSH

16、de stroyed by w et2 5 测定原料药中GSSG 的含量2 5 1 线性范围考察取GSSG 对照储备液配制并稀释成质量浓度分别为0 6、0 9、1 5、3 0、4 5、6 0m g L -1系列对照溶液。分别取上述溶液各20 L ,按 2 1 条色谱条件进样分析,测定峰面积。以质量浓度( ,m g L -1为横坐标,峰面积(A 为纵坐标,进行线性回归,得回归方程:A =6 134 103+1 117 103,r =0 9998(n =5。结果表明GSSG 质量浓度在0 66 0m g L -1内与峰面积呈良好的线性关系。方法的检测限为1 0ng ,定量限为3 0ng 。377第

17、5期孙宝丹等:HPL C 法研究还原型谷胱甘肽降解产物2 5 2 精密度试验取质量浓度为6 0m g L -1的GSSG 对照溶液20 L,重复进样6次,测得其峰面积的RSD 为0 39%,表明仪器精密度良好。2 5 3 重复性试验取GSH 原料药约30m g ,精密称定。加流动相溶解并制成每1mL 中约含300 g 的溶液(6份,按 2 1 条色谱条件进样分析,计算GSSG 含量的RSD 为1 5%,表明方法重复性良好。2 5 4 回收率试验取GS H 原料药约30mg ,精密称定。置于100mL 量瓶中,加入GSSG 对照储备液10 0mL ,加流动相稀释至刻度,摇匀(6份。按 2 1 条

18、色谱条件进样分析。以质量浓度为6 0m g L -1的GSSG 对照溶液为对照,计算回收率。结果平均回收率为99 6%,RSD 为1 4%。2 5 5 还原型谷胱甘肽原料药中氧化型谷胱甘肽的测定取还原型谷胱甘肽原料药约30mg ,精密称定。置于100mL 量瓶中,加流动相溶解制成每1mL 中约含300 g 的溶液,作为供试溶液;另精密称取GSSG 对照品适量,用流动相制成每1mL 中约含6 0 g 的溶液,作为对照溶液。取对照溶液20 L ,注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分的峰高约为满量程的10%(图8B;另取供试溶液20 L ,注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分完全出峰(图8A ,按

19、外标法计算GSH 原料中GSSG 的含量为0 32% 。A T est so l ution ;B T ontrast so l uti on ;7 GSS G;8 G S H F i g .8 H PLC chro ma togra m s of G SSG assay i ng in G SH substan ce3 结论GSH 在酸、碱、氧化、光照、高温及高湿等破坏条件下均不稳定,至少可能产生6种降解产物,且最容易产生的降解产物均为GSSG 。在此研究基础上,作者将GSSG 作为原料药质量控制指标,建立了还原型谷胱甘肽原料药中氧化型谷胱甘肽(GSSG杂质检查方法,为还原型谷胱甘肽原料药的

20、质量控制提供了保证。参考文献:意义J.国外医学:卫生学分册,2003,30(5:274-278.展J.生物技术,2004,14(1:68-70.各种测定方法比较评价J.中国临床营养杂志,2003,11(2:136-139.方法 H PLC 法的建立与验证J.中国临床药学杂志,2005,14(3:167-169.Study on the degradation products i n reduced gl uta t hi one by HPLCSUN B ao dan ,JIANG Zhen ,CHENG W e i m ing,GUO X i n g jie378沈 阳 药 科 大 学 学

21、 报第28卷(Schoo l o f Pha r m acy,Shenyang Phar m aceutica lUn iversity,Shenyang 110016,C hina Abst ract :Objective To study the degradation pr o ducts o f reduced g lutathione(G SH in various de structi o n tests and establish an H PLC m ethod fo r assay i n g g lutathione ox idized(G SSG based on abo

22、ve m en ti o ned study .M et hods C entury SI L AQ C 18co lu m n(4 6mm 200mm,5 m w as used ,t h e m obile phase w as 10mm o l L-1sodium heptanesulfonate i n 50mm o l L-1po tassiu m dihydrogen pho sphate so l u ti o n(p H 3 0m ethano l(V V =97 3,the detection w ave l e ng th w a s se t at 210nm.R esu

23、lts B y com parison w ith the reten ti o n ti m e o f the standards ,t h e m a j o r degradation products fro m sa m ples o f destr uction testsw ere identified ,i n clud i n g cy steiny lg lyc i n e ,G SSG and a m i n o ac i d s :g luta m ic ,cyste i n e ,g lyc i n e and cy stine .The con tent o f

24、G SSG in G SH substancesw as 0 32%by ex terna l standard m ethod.Conclusions The m ethod of G SSG assa y i n g is accura te ,specific and can be used in t h e qua lity standard of the drug .K ey w ords :reduced g l u tathione ;ox idized g l u tathione ;related substance ;degradati o n produc;t H PLC

25、 (上接第370页Isol ati on and i dentification on che m ical constituents of resi due of G lycyrrhiza i nflata Batal.L I N ing 1,L IU Fen 1,N I Hui 2,M ENG D a li 1,ZHANG Juan 2,JIA X iao guang2(1 K ey Labo ra to ry o f Structure B a sed D r ug D esign &D iscovery o fM i n istry o f Educa ti o n,Sheny

26、ang Pha r m a ceutica l University,Shenyang 110016,C hina;2.Xinjiang Instit u te o fC hi n eseM a teria M e d ica and E t h no drug,U ru m q i 830002,China Abst ract :Objective To study the che m ical constituents o f the resi d ue o fG lycyrrhiza inflata B ata.l i n o r der t o rev ea l the active co m ponents for the ir furth