IFN-γ调节THP-1细胞应答沙门氏伤寒菌

1、IFN-调节THP-1细胞应答沙门氏伤寒菌    李铁民江崎孝行 摘要目的：为了探讨IFN-在增强宿主防御沙门氏伤寒菌感染中的作用机制。方法：采用体外细胞培养方法研究了IFN-对THP-1细胞应答沙门氏伤寒菌的调节作用。结果：发现IFN-显著促进THP-1细胞及PMA分化的THP-1细胞内化和杀伤沙门氏伤寒菌，并明显增强沙门氏伤寒菌诱导PMA分化的THP-1细胞产生TNF-和增强诱导THP-1细胞及PMA分化的THP-1细胞产生IL-12。结论：IFN-在调节宿主单核吞噬细胞应答沙门氏伤寒菌感染中起着重要作用。 关键词干扰素沙门氏伤寒菌细胞因子 中国图书

2、分类号R392.11 Regulation of THP-1 cells by IFN- in response to Salmonella typhi strains LI Tie-Min,Tarayuki Ezaki.Department of Biology,Liaoning University,Shenyang 110036.Department of Microbiology,Gifu University School of Medicine,Japan 500 AbstractObjective:To research the enhancing mechanisms of h

3、ost defence against Salmonella typhi infection by IFN-.Methods:The regulatory role of THP-1 cells by IFN- in response to Salmonella typhi was researched in vitro.Results:IFN- significantly enhanced the activities of THP-1 cells and PMA differentiated THP-1 cells to internalize and kill Salmonella ty

4、phi strains, and also increased the production of TNF- induction in PMA differentiated THP-1 cells and the production of IL-12 induction by Salmonella typhi strains in THP-1 cells and PMA differentiated THP-1 cells.Conclusion:IFN- plays an important role in the regulation of mononuclear phagocytes i

5、n response to Salmonella typhi infection. Key wordsIFN-Salmonella typhiCytokine IFN-激活宿主免疫在应答沙门氏菌感染中起着重要作用。动物实验结果表明，沙门氏伤寒菌感染的小鼠早期注射外源IFN-，淋巴结中的细菌数量明显减少，抗IFN-抗体中和循环的IFN-，小鼠失去抵抗低剂量细菌感染能力，IFN-基因失活的小鼠对沙门氏伤寒菌感染高度易感，而且Ity缺陷(Itys)小鼠明显比Ityr小鼠易感沙门氏伤寒菌1-3。Kita等人发现，Itys小鼠产生的IFN-明显低于Ityr小鼠产生的IFN-4，来源于两种小鼠的居住吞噬细

6、胞对胞内沙门氏伤寒菌的杀伤结果也显示，Ityr小鼠的吞噬细胞杀伤胞内菌能力明显高于Itys小鼠的吞噬细胞5。这些资料充分证实了IFN-在机体防御沙门氏伤寒菌感染中的重要作用，但IFN-增强宿主免疫的机制仍不十分清楚。本文通过体外细胞培养方法研究了IFN-对THP-1细胞应答沙门氏伤寒菌的调节作用。 1材料与方法 1.1细胞系和菌株THP-1细胞，人类单核细胞白血病细胞系，本室保存，常规传代培养在含10%FBS(GIBCO，美国)和50 g/ml庆大霉素的RPMI 1640(GIBCO，美国)培基中。Gifu 10007菌株为本室保存的野生型沙门氏伤寒菌菌株。 1.2沙门氏伤寒菌培养物的制备挑取

7、Gifu 10007单个菌落接种于SOB液体培基中，37、5%CO2静止过夜培养，再转接到新鲜SOB液体培基中继续培养4 h，达到对数生长期。在感染试验中取出适量培养物，PBS洗1次，悬浮在RPMI 1640中，同时取培养物，经适当稀释后，涂平板，过夜培养后计数菌落数，以确定培养物中的细菌浓度。 1.3THP-1细胞的制备离心收获培养4 d的THP-1细胞，用预温的RPMI 1640洗2次，计数细胞数，悬在含有10%FBS和50 g/ml庆大霉素(或不含)的RPMI 1640培基中，使细胞浓度达2.0×106 ml-1或2.3×106 ml-1。 1.4PMA 处理THP-

8、1细胞在细胞悬液中加入适量PMA(Phorbol 12-Myristate 13-Acetate,Wako,日本)，使终浓度达到160 nmol/L，然后接种细胞悬液到组织培养板中，37、5%CO2条件下孵育48 h后，用预温的RPMI 1640培基洗细胞3次。 1.5IFN-活化THP-1细胞和PMA分化的THP-1细胞在THP-1细胞或PMA分化的THP-1细胞中加入浓度为1 000 U/ml的IFN-(人类重组IFN-，Genzyme,美国)，37、5%CO2条件下孵育24 h，细胞经预温的RPMI 1640培基洗1次后，用于感染试验。 1.6Gifu 10007菌感染细胞THP-1细胞

9、、IFN-活化的THP-1细胞、PMA分化的THP-1细胞和IFN-活化的PMA分化的THP-1细胞的感染，是在洗后的细胞中加入适量的Gifu 10007菌培养物，使细胞与细菌的比例约为1：10，37、5%CO2条件下孵育1 h，使细胞被感染。用预温的RPMI 1640培基洗细胞3次后，加入含10%FBS和50 g/ml庆大霉素的RPMI 1640培基，继续孵育在37、5%CO2条件下，此时作为细菌感染细胞后的起始时间。 1.7内化及胞内存活测定在细菌感染细胞后的不同时间点，去除培养上清，加入1%Triton X-100溶液，室温保持10 min，以裂解细胞释放胞内菌。稀释细胞裂解物达适当浓度

10、，接种到HI平板上，37过夜培养，计数生长的菌落数(以CFU/ml表示)。 1.8细胞因子的诱导及检测2.0×106 THP-1细胞、IFN-活化的THP-1细胞、PMA分化的THP-1细胞和IFN-活化的PMA分化的THP-1细胞，经 Gifu 10007菌感染后24 h，收集培养上清，保存于-80。用TNF-和IL-12检测试剂盒(Biotrak,英国)按其说明进行操作，酶标检测仪(Pynatech MR5000,美国)上分别测定样品的TNF-和IL-12含量。 2结果 2.1IFN-调节THP-1细胞内化Gifu 10007菌实验结果表明，IFN-显著增强THP-1细胞和PMA

11、分化的THP-1细胞内化Gifu 10007菌(图1)。 2.2IFN-调节THP-1细胞杀伤胞内Gifu 10007菌实验发现，Gifu 10007菌在THP-1细胞中增殖，但在IFN-活化的THP-1细胞中其增殖明显受到抑制。IFN-显著增强PMA分化的THP-1细胞杀伤胞内Gifu 10007菌(表1)。 2.3IFN-对Gifu 10007菌诱导THP-1细胞产生细胞因子的调节表2表明，Gifu 10007菌既不诱导THP-1细胞，也不诱导IFN-活化的THP-1细胞产生TNF- ，但可诱导PMA分化的THP-1细胞产生TNF-，IFN-显著增强PMA分化的THP-1细胞诱导产生 &#

12、160;    图1IFN-对THP-1细胞内化Gifu 10007菌株的影响 Fig.1Effect of IFN- on internalization of Gifu 10007 strains Note:A.THP-1 cells;B.THP-1 cells activated by IFN-；C.PMA differentiated THP-1 cells;D.PMA differentiated THP-1 cells activated by IFN-；*P<0.05,*P<0.01 表1IFN-对Gifu 10007菌株存活在THP-1

13、细胞内的影响 Tab.1Effect of IFN- on intracellular survival of Gifu 10007 inside THP-1 cells Cell states 1 h postinfection 24 h postinfection % survival CFU/ml() (±s) THP-1 cells 4.16×104 11.50×104 257.80±7.83 THP-1 cells activated by IFN- 7.25×104 11.49×104 158.30±9.541)

14、 PMA differentiated THP-1 cells 1.15×105 4.00×104 34.88±1.08 PMA differentiated THP-1 cells activated by IFN- 2.18×105 1.53×104 6.98±1.021) Note:1)P<0.01 表2IFN-对Gifu 10007菌株诱导THP-1细胞产生TNF-和IL-12的影响(±s) Tab.2Effect of IFN- on production of TNF- and IL-12 inductio

15、n by Gifu 10007 in THP-1 cells (±s) Cell states TNF-(pg/ml) IL-12(pg/ml) THP-1 cells 0.00 51.24±9.08 THP-1 cells activated by IFN- 0.00 1 104.55±77.232) PMA differentiated THP-1 cells 133.22±22.52 59.08±8.02 PMA differentiated THP-1 cells activated by IFN- 1 517.69±89.0

16、92) 117.02±11.721) Note:1) P0.05, 2)P0.01 TNF-。IFN-既可显著增强Gifu 10007菌诱导THP-1细胞产生IL-12，也可增强PMA分化的THP-1细胞产生IL-12。 3讨论 单核吞噬细胞是机体防御胞内菌感染的主要细胞，而且实验已充分证实，宿主对沙门氏伤寒菌感染的应答需要IFN-参与1-4，但IFN-如何调节单核吞噬细胞抵御沙门氏伤寒菌感染仍不十分清楚。 我们以前的实验结果表明，IFN-增强THP-1细胞CD14表达6。最近Schiff等人报道，CD14介导THP-1细胞吞噬G-菌7，所以在我们的实验结果中，IFN-增强THP-1

17、细胞和PMA分化的THP-1细胞内化沙门氏伤寒菌可能与IFN-增强THP-1细胞CD14表达有关。Ishibashi和Arai报道，IFN-增强小鼠巨噬细胞杀伤胞内沙门氏伤寒菌活性是增强含菌吞噬体与溶酶体的融合水平8。我们的实验结果表明，IFN-明显增强THP-1细胞抑制胞内沙门氏伤寒菌生长，显著增强PMA分化的THP-1细胞杀伤胞内沙门氏伤寒菌。如果IFN-增强THP-1细胞杀伤胞内沙门氏伤寒菌活性是依赖增强吞噬体与溶酶体融合水平的机制，那么，PMA分化的THP-1细胞杀伤胞内沙门氏伤寒菌活性可能与PMA促进THP-1细胞溶酶体成熟有关，因为我们实验发现，PMA促进THP-1细胞分化为成熟巨

18、噬细胞(文中未表明)，我们正在进行这方面研究。 我们的实验结果表明，IFN-不增强沙门氏伤寒菌诱导THP-1细胞产生TNF-，但显著增强沙门氏伤寒菌诱导THP-1细胞和PMA分化的THP-1细胞产生IL-12，然而，增强诱导THP-1细胞产生IL-12明显高于诱导PMA分化的THP-1细胞产生IL-12。这些实验结果提示，单核细胞的分化成熟程度影响TNF-表达，但不影响IL-12表达；两种细胞因子的诱导表达均需IFN-作为活化信号；PMA虽然可促进THP-1细胞分化成熟，但不增强IL-12表达，而且可能在IL-12产生的某个环节上PMA限制IFN-活化的THP-1细胞表达IL-12，这一实验结

19、果与Kubin等人报道的结果相似9。 我们的实验结果充分证实了IFN-在调节单核吞噬细胞活性中的重要作用。它一方面直接作用于单核吞噬细胞，增强内化和杀伤沙门氏伤寒菌；另一方面，作为细胞活化信号增强沙门氏伤寒菌诱导产生细胞因子。近年研究表明，IL-12可诱导Th1细胞和NK细胞产生IFN-，反过来，IFN-又可调节单核吞噬细胞产生IL-1210。这样的正反馈调节机制在体内既可放大单核吞噬细胞活性，又可维持Th1细胞应答，所以，进一步深入研究IFN-对单核吞噬细胞的其它调节活性和影响IFN-表达的调节因素将对我们充分认识机体对沙门氏伤寒菌应答具有十分重要意义。 日本岐阜大学医学部微生物学教研室，日

20、本500 作者简介：李铁民，男，39岁，博士生，副教授，主要从事抗感染免疫研究； 江崎孝行，男，48岁，博士，教授，主要研究抗感染免疫 作者单位：辽宁大学生物系微生物学教研室，沈阳110036 4参考文献 1Nauciel C,Espinasse M F.Role of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha resistance to salmonella typimurium infection.Infect Immun,1992;60:450 2Hess J,Ladel C,Midko D et al.Salmonella typ

21、himurium aroA-infection in genetargeted immunodeficient mice:major role of CD4+ TCR-alpha beta cells and IFN-gamma in bacteria clearance independent of intracellular location.J Immunol,1996;156:3321 3Vidal S,Tremblay M L,Govoni G et al.The Ity/Bcg locus:natural resistance to infection with intracell

22、ular parasites is abrogated by disruption of the Nrampl gene.J Exp Med,1995;182:655 4Kita E,Emoto D,Oku F et al.Contribution of interferon gamma and membrane-associated interleukin 1 to the resistance to murine typhoid of Ityr mice.J Leukocyte Biol,1992;51:244 5Van Dissel J,Leijh P C,Van Furth F R.Differences in initial rate of intracellular killing of salmonella typhimurium by resident peritoneal macrophages from various mouse strains.J Immunol,1985;134:3404 6Hirose K,Ezaki T,Miyake M et al.Survival of Vi-capsulated and Vi-dele ted salmonella typhi