CRP、IL-6、TNF-α与移植物动脉硬化早期发病的关系

1、CRP、IL-6、TNF-与移植物动脉硬化早期发病的关系作者：石萍，孙文宇，杨敏作者单位：山东大学齐鲁医院 小儿心脏内科; 心脏外科； 护理部， 济南 250012 【摘要】 目的 探讨血清炎症因子与移植血管动脉硬化早期发病的关系。方法 将36只同种异体胸主动脉腹腔移植大鼠分成4个实验组,每组9只。A组术后1周处死； 作者：石萍，孙文宇，杨敏作者单位：山东大学齐鲁医院 小儿心脏内科; 心脏外科； 护理部， 济南 250012 【摘要】 目的 探讨血清炎症因子与移植血管动脉硬化早期发病的关系。方法 将36只同种异体胸主动脉腹腔移植大鼠分成4个实验组,每组9只。A组术后1周处死；B组术后2周处死；

2、C组术后3周处死；D组术后4周处死。16只同系移植对照大鼠对应每个实验组，每次处死4只。术前及处死时抽血分离留取血清，采用酶联免疫吸附法检测C-反应蛋白（CRP）、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子（TNF-）水平；处死后留取血管标本，HE染色观察血管病理改变，用免疫组织化学法检测血管外膜炎症细胞浸润及-肌动蛋白(-actin)、周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、增殖细胞核抗原(PCNA)在血管壁中的表达。对比各组与术前血清炎症因子水平变化及各组间观察指标的变化。结果 CRP水平，各实验组及对照组均较术前基础水平明显增高（P0.01），B、C、D实验组较对照组明显升高（P0.01）；IL-

3、6水平，B实验组较术前升高（P0.05），A、C、D实验组较术前明显升高（P0.01），A、B、C对照组较术前基础水平升高（P0.05），A、C、D实验组较对照组水平明显升高（P0.01）；TNF-a水平，A、B、C实验组较术前升高（P0.05），D实验组较术前明显升高（P0.01），各对照组与术前无明显变化，各实验组均较对照组明显增高（P0.01）。术后7 d，外膜大量炎症细胞浸润；术后14 d，外膜有轻度胶原纤维增生伴炎症浸润；术后28 d，外膜明显增厚，内有大量增生的平滑肌细胞、胶原纤维及炎症细胞，血管中层断裂，可见外膜平滑肌细胞迁移至内膜，内膜亦出现明显纤维化及平滑肌细胞增生。在血管外

4、膜平滑肌细胞中，-actin、PCNA和CDK1表达逐渐升高（P0.05），且早于内膜。结论 大鼠同种异体胸主动脉腹腔移植后血清炎症介质水平呈持续升高，说明各种免疫因素导致外膜炎症反应，并参与移植血管动脉硬化的早期发病。 【关键词】 移植物动脉硬化；C-反应蛋白；白细胞介素6；肿瘤坏死因子；炎症反应；大鼠 CRP, IL-6 and TNF- in the pathogenesis of allograft arteriosclerosis in rats SHI Ping,SUN Wen-yu，YANG Min （Department of Pediatric Cardiatric; Dep

5、artment of Cardiatric Surgery; Department of Nurse, Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China) Abstract： Objective To study the role of serum inflammatory factors and allograft adventitial inflammation in the pathogenesis of allograft arteriosclerosis in rats. Methods Thirty-six allo

6、graft rats and 16 within strain control rats were randomly divided into 4 groups (9 experimental rats and 4 controls): group A, sacrificed at the first post-operative week; group B, sacrificed at the second post-operative week; group C, sacrificed at the third post-operative week; and group D, sacri

7、ficed at the fourth post-operative week. Blood samples were collected before the transplantation operations and at the time of sacrifice. The method of Enzyme Linked Immunosorbent Assay was used for serum inflammatory factors (CRP, IL-6 and TNF-), HE staining for pathologic changes of aortic allogra

8、ft and immunohistochemical method for adventitial inflammatory cell infiltration, -actin, CDK1 and PCNA. The inflammatory factors and other observation results were compared between groups and the pre-operative groups. Results CRP level significantly increased in all control groups and experimental

9、groups (P0.01) and of B, C and D experimental groups were higher than the controls (P0.01). IL-6 level increased in the experimental group B (P0.05) and significantlyincreased in groups A, C and D (P0.01) and in the control groups A, B and C (P0.05), but it was significant higher in the experimental

10、 groups than in the control groups (P0.01). TNF- level had no difference between the controls and the preoperative basal levels, all experimental groups had higher levels than the preoperative and control groups (P0.01). Adventitial inflammatory cell infiltration was found in the allograft groups 7

11、days after the transplantation, mild adventitial collagen fiber proliferation accompanied by inflammatory infiltration was found in the allograft groups 14 days after the transplantation, and significantly adventitial proliferation with smooth muscle cells, collagen fiber and inflammatory cells, int

12、imal fibrous degeneration and smooth muscle cell proliferation were found in the allograft groups 28 days after the transplantation. In allograft adventitial smooth muscle cells, the expressions of -actin, PCNA and CDK1 were increased (P0.05) and preceded the expressions in intimal smooth muscle cel

13、ls. Conclusion The serum inflammatory factor levels in thoracic aorta transplantation rats gradually increase, indicating that increased inflammatory factors and allograft adventitial inflammation resulting from immune or non-immune factors and adventitial SMC proliferation are both involved in the

14、pathogenesis of early allograft arteriosclerosis. Key words： Allograft arteriosclerosis; C-reactive protein; Interleukin-6; Turmor necrosis factor-; Inflammatory reaction; Rat 移植物动脉硬化(allograft arteriosclerosis, AA)表现为严重的、弥漫性的血管内膜增生，最终导致血管腔狭窄、闭塞，移植器官缺血性功能衰竭，最常见于心脏移植,是限制心脏移植者长期存活的主要因素1。AA的病理生理过程与传统动脉

15、粥样硬化形成有诸多不同，其发病机制可能是一个由免疫因素及非免疫因素均参与其中的病理生理过程。免疫因素为主导，主要涉及急性或者慢性排斥反应。传统动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS) 一直被视为一种内膜疾病，同时有中膜层参与。近年研究表明2320，血管外膜炎症也可出现在AS疾病中,多种炎症细胞因子参与炎症反应，如单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白细胞介素(interleukin，IL)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-，TNF-)、C-反应蛋白（C-reactive protein，C

16、RP）和血小板衍化生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)等，使中膜平滑肌细胞向内膜迁移、增殖并合成细胞外基质。本研究旨在通过建立大鼠胸主动脉腹腔移植慢性排斥反应动物模型，探讨CRP、IL-6和TNF-等炎症因子在移植物动脉硬化早期形成中的作用。 1 材料与方法 1.1 实验动物 实验组受体为近交系Wister大鼠，共36只，均为雄性，34月龄，体重250350 g，购自山东大学医学院实验动物中心。供体为近交系Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄各半，共36只，体重130150 g,购自成都达硕生物科技有限公司。对照组供、受体均为Wister

17、大鼠，共32只。所有动物在购买前均由出售单位监测证实健康未带病毒。大鼠按标准喂以混合饲料及清水。 1.2 主要仪器与试剂 人工晶体置入显微器械（苏州医疗器械厂，鹤牌），GD350-B型高频电刀（HF ELECTROTOME），胸主动脉套管（外径1.7 mm，内径1.5 mm，自制），美国BIO-RAD450 型酶标仪，高精度加液器及吸头，自动洗板机，37 温箱，石蜡包埋组织轮转切片机（RM2145），石蜡包埋机（EG1160），摊片机（HI1210），自动密封式组织脱水机（P1050），水浴设备，PBS（pH7.27.6，Gibco），-actin、CDK1及PCNA抗体和SABC免疫组化试剂

18、盒(ZYMEB)，大鼠CRP、IL-6和TNF- ELISA试剂盒(Sigma)均购自晶美生物工程公司。 1.3 动物分组 A组：异系移植实验大鼠9只，术后1周处死;B组：异系移植实验大鼠9只，术后2周处死;C组：异系移植实验大鼠9只，术后3周处死;D组：异系移植实验大鼠9只，术后4周处死。 对照组也分为A、B、C、D组，为同系移植，对应每个实验组，每次处死4只。 1.4 同种异体胸主动脉腹腔移植模型建立3。 1.41 供体手术 腹部正中切口,暴露下腔静脉,注入肝素盐水5 mg/kg,全身肝素化。沿剑突向上迅速剪开胸骨,并向两侧切除部分胸壁。于膈肌和锁骨下动脉处剪断胸主动脉,用眼科剪仔细游离胸

19、主动脉全长。迅速将游离好的胸主动脉放入冰盐水中冲洗、修剪。用微型剪将待移植的胸主动脉残端的两侧各剪开管壁约2 mm,使其分成两部分以利翻转钳夹用。采用16G Teflon 静脉留置针自制套管(长约3 mm,分管体和延长部，后者以利固定用)，将胸主动脉两端分别通过套管,用眼科镊夹住残端两部分翻转于套管上,3-0号丝线结扎套管固定。 1.42 受体手术 腹部正中切口,剪开后腹膜,将肾动脉与腰升动脉间的腹主动脉游离,在其两端各绕过1根3-0号丝线以备结扎用。按2 mg/kg的用量皮下注射肝素。于肾动脉处及腰升动脉下方分别用小血管夹阻断腹主动脉。在两血管夹中间斜行剪开2/3腹主动脉，将待移植的胸主动脉

20、上端套管插入腹主动脉内,3-0备用丝线结扎，然后将结扎线与套管固定线打结进一步固定以防滑脱。下端吻合方法同上。待吻合完成后，依次开放腰升动脉、肾动脉处动脉夹，移植血管迅速充盈，搏动明显。缝合后腹膜，腹腔放置青霉素40 000 U、庆大霉素5 000 U,关腹。 1.5 标本采集及检测方法 受体大鼠术前及处死时留取血液标本，2 000 r/min离心10 min，将血清统一编号分装置于-20 保存备用。切取移植血管标本，置入4中性福尔马林溶液固定待检。 1.5.1 CRP、IL-6和TNF-的检测 采用双抗体夹心酶联免疫吸附法。 1.5.1.1 标准曲线的绘制 将已知浓度的标准品稀释成不同浓度：

21、IL-6分别稀释至8 000、4 000、2 000、1 000、500、250、125和0 pg/mL;TNF-分别稀释至2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625和0 pg/mL;0 pg/mL设为空白孔，除空白孔外分别取不同浓度的标准品100 L加入相应的孔中，用封板胶纸封住反应孔，37 孵箱孵育90 min，洗板4次。除空白孔外，各加入生物素化抗体100 L/孔，用封板胶纸封住反应孔，37 孵箱孵育60 min，洗板4次。除空白孔外，各加入酶结合物100 L/孔，封住反应孔，37 孵箱孵育30 min，洗板4次。加入显色剂100 L/孔，37 避

22、光显色1520 min，最后加入终止液100 L/孔，混匀后即刻用BIO-RAD450 型酶标仪自动读取标准品各不同标准浓度下波长450 nm处的光密度值（OD450），自动绘制光密度-浓度曲线。 1.5.1.2 检测步骤 从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条； 除空白孔外，分别将标本(100 L/孔)加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，37 孵箱孵育90 min； 洗板4次； 除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100 L/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37 孵箱孵育60 min； 洗板4次； 除空白孔外，加入酶结合物工作液(100 L/孔)；用封板胶纸封住反应孔，37 孵箱孵育30 min；

23、 洗板4次； 加入显色剂100 L/孔，避光37 孵箱孵育1020 min； 加入终止液100 L/孔,混匀后即刻测量OD450值(5 min内)。 1.5.1.3 结果判断 测定出光密度值后，根据标准品浓度-光密度值曲线自动读取检测样本的浓度。为消除本底因素对实验结果的影响，得到的OD值均为不同样品的测得值减去空白对照孔OD值的差。 1.5.2 移植血管组织病理学检查 1.5.2.1 HE染色 胸主动脉移植术后第1、2、3、4周时处死动物，切取移植胸主动脉，用4中性福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋、行HE染色，光镜下观察。 1.5.2.2 免疫组织化学染色 免疫组化染色计分法：根据免疫组化染色

24、阳性细胞数在每一高倍视野中所占比例进行统计3。0级：无阳性细胞；1级：每一高倍视野中可见散在或小片染色阳性细胞；2级：每一高倍视野中可见片状染色阳性细胞，其阳性细胞数不超过同一视野中总细胞数的50%；3级：阳性细胞数超过同一视野中总细胞数的50%。 1.6 统计学处理 使用SPSS 12.0统计分析软件进行统计分析。实验数据用xs表示，组间比较采用t检验；等级资料采用Ridit分析，求得Ri值。P0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1 CRP、IL-6、TNF-水平的表达 胸主动脉移植术后，A、B、C、D四实验组血清CRP、IL-6、TNF-水平均较术前基础水平增高，见表1；各对照组手

25、术前、后水平变化见表2。 表1 胸主动脉移植前后各实验组血清CRP、IL-6和TNF-浓度的比较（略） *P0.05，*P0.01 vs 术前 表2 胸主动脉移植前后各对照组血清CRP、IL-6和TNF-浓度的比较（略） *P0.05，*P0.01 vs术前 2.1.1 CRP水平 自术后1周，每组CRP水平明显升高（P0.01），亦明显高于对照组（P0.01），见图1。 图1 大鼠胸主动脉移植术后血清CRP水平变化趋势图（略） Fig.1 Changes of Serum CRP levels post-operatively 2.1.2 IL-6水平 术后1周，实验组较术前升高（P0.05

26、），术后3、4周较术前明显升高（P0.01），实验组总体水平较对照组明显升高（P0.01），见图2。 图2 大鼠胸主动脉移植术后血清IL-6水平变化趋势图（略） Fig.2 Changes of serum IL-6 levels post-operatively 2.1.3 TNF-水平 术后1周，实验组较术前升高（P0.05），以后升高缓慢。各实验组均较对照组明显增高（P0.01），见图3。 图3 大鼠胸主动脉移植术后血清TNF-a水平变化趋势图（略） Fig.3 Changes of serum TNF- levels post-operatively 胸主动脉移植后，各实验组血清CRP

27、、IL-6和TNF-水平均较术前基础水平明显升高，持续时间长，且有随时间继续升高之趋势，各对照组血清CRP和IL-6水平亦较术前升高，但上升幅度较实验组小，术后渐趋平稳或呈下降趋势，各对照组血清TNF-水平则与术前无明显变化。 2.2 移植动脉的病理变化 术后7 d，外膜大量炎症细胞浸润，可见散在的-肌动蛋白(-actin)阳性细胞，滋养血管的平滑肌细胞也开始增殖。术后14 d，外膜有轻度胶原纤维增生伴炎症浸润，在移植血管外膜及其滋养血管中可见-actin灶状表达。术后28 d，外膜明显增厚，内有大量增生的平滑肌细胞、胶原纤维及炎症细胞，血管中层断裂，可见外膜平滑肌细胞迁移至内膜（图4），内膜

28、亦出现明显纤维化及平滑肌细胞增生，-actin片状或多灶性分布表达（图5）。增殖细胞核抗原(PCNA)表达最早，术后7 d于炎性浸润的外膜中即有表达，术后第28 d在滋养血管表达明显，其分布同-actin相当，周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)的表达亦首先出现在外膜增生的平滑肌细胞和滋养血管，随时间推移其表达程度愈来愈高。-actin、PCNA和CDK1的在血管的表达外膜早于内膜。对照组仅见少量表达。 图4 实验组术后28 d，血管中层断裂，外膜平滑肌细胞增殖迁移伴炎性细胞浸润(200)（略） Fig.4 Adventitial smooth muscle cells proliferation

29、 and immigration accompanied by inflammatory infiltration with mid-membrane rupture were found 28 days after the operations(200) 图5 实验组术后28 d，血管外膜平滑肌细胞可见大量a-actin 阳性细胞表达(200)（略） Fig.5 Expression of -actin was found in adventitial smooth muscle cells 28 days after the operations(200) 3 讨论 近年动物实验表明4，内

30、膜损伤出现之前主动脉外膜就有大量巨噬细胞浸润。由此可见，外膜炎症在AS早期就已出现。而对人体标本的研究也证实了外膜炎症的存在。Moreno等5对人腹主动脉标本的观察发现，外膜炎症在粥样硬化的动脉中广泛存在，且与AS的严重程度成正相关。内膜的变化可能与动脉外膜炎症时多种细胞因子及粘附蛋白的分泌有关。这些炎性细胞分泌的IL-1、TNF-、MCP-1等是重要的细胞因子，参与AS的免疫反应，在AS形成中起重要作用6。 动脉外膜炎症还可以作用于中膜，促进AS的发生、发展。外膜炎症发生后，相对应的血管中膜平滑肌细胞在1周内大量增殖，血管中膜靠近外膜炎细胞的平滑肌细胞表型改变并大量增殖7，提示炎细胞可能以旁

31、分泌方式刺激周围平滑肌细胞的分化和增殖。淋巴细胞、巨噬细胞和肥大细胞8等多种炎细胞聚集在外膜组织和外膜滋养血管中。肥大细胞是唯一含组胺的细胞，激活的肥大细胞释放组胺直接扩散进入动脉中膜，也可以通过滋养血管将组胺输送到动脉中膜，组胺与中膜平滑肌上的组胺受体结合引起平滑肌收缩。另外，前列腺素D2、白三烯C4等血管活性物质和组胺一样，都能导致冠状动脉痉挛。冠状动脉的持续痉挛会造成血管内皮细胞缺血、缺氧而受损，继发AS。 CRP是对各种急性损伤、感染或其它炎症刺激的急性反应产物，其本质是一种由肝脏合成的球蛋白。动脉硬化病灶亦能产生CRP，并成为血清CRP水平升高的重要来源9。正常情况下CRP含量极低，

32、急性炎症反应阶段可迅速增加，因此血清CRP水平与炎症反应的程度密切相关。本研究结果显示，术前血清CRP基础水平较低，术后对照组及实验组均急剧升高，实验组较对照组增高更明显，且随时间延长呈上升趋势，说明动脉移植后各种因素导致的强烈的炎症性反应持续存在。因此，CRP在一定程度上反映移植术后体内炎症反应的强度。但CRP反应是非特异的，可由急性感染等与血管疾病无关的状态所激发。增高的CRP水平不仅是炎症反应的一种标志，其本身还可作为介质促进疾病的发生发展。白细胞介素-6是一种多功能的细胞因子，在体内具有广泛的生物学效应2321。IL-6的主要生物活性有促进细胞分化，加速肝细胞急性期蛋白的合成和分泌，刺

33、激细胞生长增殖，参与骨的吸收等等。近年研究表明2321，动脉粥样硬化病灶中可检出CRP与IL-6；IL-6在动脉粥样硬化壁中的浓度为血清浓度的200倍，且可作用于血管壁而引起血管壁的损伤，促进血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的增生，参与动脉粥样硬化的形成和发展。TNF-是一种主要由单核巨噬细胞释放的细胞因子，对多种细胞的生长、分化和功能具有抑制或刺激的多重效应。血管内皮细胞及平滑肌细胞亦可分泌TNF-，参与动脉粥样硬化的形成与发展。本研究结果显示，同种异体动脉移植术后血清IL-6及TNF-水平升高，实验组较对照组增高更明显且呈继续上升趋势，说明这些炎症细胞因子在移植血管动脉硬化的发生与发展过程中起

34、一定作用。其机制可能为上调粘附分子及化学因子的表达，增加炎症细胞的聚集，通过其强烈的致炎作用，促进内皮细胞活化，促进平滑肌细胞增殖及表型转变，通过增加MHC分子在抗原递呈细胞及内皮细胞上的表达而增强免疫反应的发生，内皮细胞及平滑肌细胞又能通过其不同程度地激活T细胞，如此形成恶性循环导致动脉硬化的发生发展。血管壁平滑肌细胞由2种类型构成，一种是分化型细胞，一种是具有分化潜能的平滑肌细胞，后者多分布于外膜，此类平滑肌细胞一旦受到某些生长因子的刺激即迅速增殖。分化型的平滑肌细胞还可发生表型转化，具有分泌和分裂增殖能力。本研究结果表明，实验组术后第7 d外膜可见散在的-actin阳性细胞，血管外膜大量

35、炎症细胞浸润，滋养血管的平滑肌细胞也开始增殖。术后第28d，外膜可见大片增殖的平滑肌细胞，表现为外膜和滋养血管的-actin阳性细胞数明显增多，呈小片状或多灶性分布，在-actin阳性细胞中可见PCNA和CDK1高度表达，表明外膜平滑肌细胞处于增殖分裂活跃状态。外膜纤维化较明显，血管中层断裂，外膜平滑肌细胞迁移至中层、内膜。内膜于术后28d仅有少量-actin阳性细胞表达，表明外膜平滑肌细胞早期激活并大量分裂增殖是造成移植血管动脉硬化发生发展的一个重要原因。 通过同种异体胸主动脉腹腔移植模型实验表明，移植后早期血管外膜炎症反应明显，血清炎症介质如CRP、IL-6及TNF-水平呈持续升高。通过其

36、强烈的致炎作用，导致外膜平滑肌细胞早于内膜大量增殖分裂，并迁移入中层及内膜，在移植血管动脉硬化的早期发生中起着重要作用。 【参考文献】 1 Kass M, Haddad H. Cardiac allograft vasculopathy: pathology, prevention and treatmentJ. Curr Opin Cardiol, 2006, 21(2):132-137.2 Ramzy D, Rao V, Brahm J, et al. Cardiac allograft vasculopathy: a reviewJ. Can J Surg, 2005, 48(4).3 孙文宇，于仲芬，袁桂荣，等大鼠模型动脉硬化形成中多种周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶表达J中国公共卫生，2001，17（7）：601-6034 Rayner K, van Eersel S, G