组织因子途径抑制物的生理功能及临床应用价值

1、组织因子途径抑制物的生理功能及临床应用价值         【摘要】  组织因子途径抑制物（TFPI）是组织因子、因子和因子的天然抑制物，在维持正常凝血中发挥关键的生理作用。近年来，随着对TFPI结构与功能研究的深化，发现它还能抗炎症和诱导凋亡，并在动脉粥样硬化、败血症和恶性肿瘤等疾病的治疗上有重要的应用价值。本文将对TFPI的生理作用和临床应用前景进行综述。【关键词】  组织因子途径抑制物；结构；功能；生理作用；临床应用  Physiological functions a

2、nd applications of tissue factor pathway inhibitor【Abstract】  Tissue factor pathway inhibitor (TFPI)，the inherent inhibitor of tissue factor (TF) and factors and ，is a key molecule that plays a regulatory role in the physiological coagulation.Peoples knowledge on its structure and functions has

3、 been intensively enlarged in recent years.Besides the functions of anti-inflammation and introducing apoptosis，it was also found that TFPI could be served as medicine in treating some diseases such as atherosclerosis，sepsis and malignancy.This paper is a review mainly on the physiological functions

4、 and applications of TFPI.【Key words】  TFPI; structure; function; physiological effect; application   组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是外源性凝血途径的天然抑制物。该因子早在20世纪初就被发现，但直到上世纪80年代，人们才对其展开深入系统的研究。1983年，Sander等首先阐明了TFPI抑制外源性凝血途径的机制。1988年，Wun等首次克隆TFPI的cDNA，并据此推断出它的氨基酸组成和空间构型，将其

5、隶属于Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物家族。1990年后，人们先后对TFPI的基因定位、表达调控、分子生物学特性、基因工程表达、其他生理学功能，以及一系列疾病的治疗作用进行了研究，获得了许多重要进展。TFPI以其重要的生理学意义和对重大疾病的治疗价值，吸引着人们对它的进一步关注。1  TFPI 基因和蛋白的结构特点1.1  TFPI的基因结构与定位  TFPI基因全长约86kb，定位于 2q312q32.1，由9个外显子和8个内含子组成。其中外显子1和2编码 TFPI mRNA 的5端非翻译区，外显子3编码信号肽及N末端，外显子4、6、8分别编码TFPI的K1、K

6、2和K3结构域，外显子5和7编码K1、K2和K3之间的两段连接区，外显子9编码C末端和3端非翻译区。由于剪切形式的不同，TFPI 基因在转录后形成 4kb 和 1.6kb 2种mRNA，后者缺乏外显子2（约2.6kb）。TFPI基因的上游调控区缺少TATA盒和GATA盒，它的转录主要受GATA元件的调控，转录因子GATA-2与TFPI表达呈明显相关性1。1.2  TFPI的蛋白结构  TFPI 是一种全长由276个氨基酸残基组成的耐热单链糖蛋白，含K1、K2和K3三个Kunitz结构域，另外还包括2个连接区以及一个富含酸性氨基酸的N末端和一个富含碱性氨基酸的C末端。TFPI

7、的空间结构比较复杂，所含18个半胱氨酸残基构成9对二硫键，参与维持其二级结构，此外该蛋白还在117、167和228位的N原子上有糖基化修饰。结构域K1和K2是 TFPI 发挥抗凝活性的关键部位，K3在该作用中并非必需，但它的存在可以使 TFPI 更好地抑制凝血。近年来有不少研究表明，K3和C末端可以和肝素、膜表面糖蛋白及多糖结合2，另外该区域还与 TFPI 的抗炎作用有关。糖基化修饰几乎与 TFPI 生物活性无关。2  TFPI的生理功能生理条件下，TFPI主要由微血管内皮细胞合成，大部分锚着于内皮细胞，少量以游离形式存在，或者与脂蛋白、血小板结合后进入血流循环。TFPI的恒定表达对

8、于内皮细胞的抗凝血功能及维持血液的正常流动非常重要。 经典凝血理论将凝血途径分为外源性凝血途径和内源性凝血途径，其中外源性凝血途径是生理性止血的主要途径。血管内皮细胞受损时，内皮下细胞表面的组织因子（tissue factor，TF）暴露于血液，外源性凝血途径立即启动。TF与血液中少量的F（Fa）结合，形成Fa/TF复合物，而后活化F和少量F，活化的F（Fa）激活凝血酶原变为凝血酶，从而引起凝血，少量Fa对F的激活则产生放大作用。但是，2004年 Genmin Lu 等人通过反应动力学实验发现，生理条件下 a/TF 活化的产物中，Fa 的活性明显超过 Fa 的活性，进而提出外源性凝血途径的早期

9、是以 F 活化为主，而 Fa 则更倾向于是Fa 的活化产物3。TFPI 是外源性凝血途径中主要的抑制因子，其抑制作用是分两步实现的：首先，TFPI 通过K2与活化的 F 结合，并竞争性地抑制其活性，该过程是一个 Ca2+非依赖的可逆性过程；然后，Fa/TFPI 复合物中的 TFPI 通过 K1 与Fa/TF 复合物中的 Fa 活性部位结合，从而实现对 Fa/TF 复合物的抑制。Fa 轻链中谷氨酸残基上的-羧基与Ca2+结合，并通过“钙桥”结合于Fa/Fa/TF 复合物中 TF 附近的磷脂表面，使得 Fa/TFPI 与 a/TF 形成稳固的 Fa/TFPI/a/TF 四元复合物，该复合物可以被单

10、核细胞和内皮细胞等吞噬清除。TFPI 和抗凝血酶（anti-thrombin ，AT）都能与 Fa 结合并抑制后者的活性。AT 对 Fa 的抑制是不可逆的。当外源性凝血途径激活后，产生大量的 Fa，AT 快速与 Fa 结合并显着地抑制其活性3，所形成的复合物最后被清除。TFPI 与 Fa 的结合是一个可逆过程，两者结合后一部分 Fa 的活性受到抑制。更重要的是，Fa/TFPI 复合物能在外源性凝血途径活化的起始阶段对 a/TF 进行抑制，从而在根本上阻断 F 和 F 的大量活化，避免了凝血因子及 AT 等抑制因子的大量消耗。由此可见，TFPI 在外源性凝血途径的负反馈调节中起着非常重要的作用。

11、3  TFPI 的抗炎功能感染性疾病患者常出现血液的高凝状态。炎症反应与凝血反应之间显然存在着某些联系。近年来发现，细菌及其释放的内毒素一方面刺激某些炎症细胞产生大量的前炎症细胞因子，如 IFN-、IL-1 和 TNF- 等，它们均能刺激内皮细胞和单核细胞高度表达 TF；另一方面，细菌或内毒素也能直接刺激内皮细胞和单核细胞表达 TF。Fa 和凝血酶也能刺激激活的单核细胞和内皮细胞，合成并释放 IL-6、IL-8 和其他炎症反应因子，这些炎症因子又通过自分泌或旁分泌的形式，促使 TF 在这些细胞中高表达4，5。可见炎症与凝血是一种相互促进、相互恶化的关系。炎症反应主要通过外源性凝血途径

12、引起血液高凝。TFPI 能从 Fa 和 TF水平阻断炎症反应与凝血反应之间的恶性循环，同时发挥抗凝抗炎的作用。动物实验发现，静脉注入外源性 TFPI，可以降低血浆中 IL-6 和 IL-8 等炎症因子的水平，动物的存活率或存活时间都有所改善6。TFPI 也具有直接的抗炎症作用。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）进入体内引起炎症反应时需要有脂多糖结合蛋白（LPS binding protein，LBP）的存在。LBP 不仅介导 LPS 与 CD14 结合，导致炎症反应，而且还能增加单核细胞及分叶细胞对 LPS 的敏感性。TFPI 可以干扰 LPS 与 LBP 的结合，或者通过

13、其K3 及 C 末端与 LPS 直接结合，竞争性抑制 LPS 与 LBP 的结合7，最终发挥抗炎作用。4  TFPI 与细胞凋亡和增殖Tsutomu Hamuro 首次发现 TFPI 可以诱导血管内皮细胞产生凋亡8。目前认为 TFPI 诱导凋亡的结构主要集中在 C 末端，与其抗凝作用无关。TFPI 诱导凋亡可能与极低密度脂蛋白（VLDL）受体有关，但仅有 TFPI 与 VLDL 受体结合并不足以启动细胞凋亡，因此推测还有其他分子在起作用9。此外，有研究发现 TFPI 的 C 末端能抑制平滑肌细胞的增殖10，其机制尚不清楚。TFPI诱导内皮细胞凋亡和抑制平滑肌细胞增殖对血管形成是一种负

14、调节，有可能是其抑制肿瘤生长的机制之一。5  TFPI的应用价值5.1  TFPI与动脉粥样硬化  TF 的暴露或高表达与许多血栓性疾病的发生发展密切相关。其中，对动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的研究较多。在AS患者增厚的内膜、斑块部位的间质和细胞都能检测到 TF 的高表达，而且越靠近斑块脂质核心 TF 表达水平越高。作为对 TF 升高的一种代偿性调节，TFPI 在 AS 中表达水平也是升高的，它和 TF 同时出现在斑块区内皮细胞、坏死区周围的巨噬细胞和平滑肌细胞中，但 TFPI 的数量远远达不到抑制 TF 的水平。一旦斑块破裂，大量 TF

15、暴露并激活外源性凝血途径，最终在局部形成血栓，是引起急性冠脉综合征或脑梗死根本原因。临床观察发现 TF 与急性心肌梗死和不稳定性心绞痛有明显的相关性11，因此抑制 TF 活性对 AS 及急性冠脉综合征的防治有着重要的意义。Badimon 等通过离体实验发现，重组 TFPI 能显着降低血小板及纤维蛋白在斑块破裂部位的沉积12，证实了 TFPI 在治疗 AS 中的有效性，动物实验也显示出同样的效果。除了容易形成血栓外，内膜增生也是 AS 发病过程中的一个重要方面。内膜过度增生所导致的远端供血不足是不稳定性心绞痛发作的重要原因。Pierre 等人将 TFPI 基因局部转染到经球囊损伤的 AS 血管，

16、发现内膜增生受到明显抑制13。因此，TFPI 的抗凝及抑制内膜增生的作用可能在 AS 和冠脉综合征的治疗中发挥作用。5.2  TFPI与深静脉血栓  手术过程中对组织的损伤使大量的TF暴露于血液，容易形成高凝状态或急性血栓。Dahm 等发现游离型和总TFPI的减少是深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）的危险因素14。TF与TFPI之间的失衡，即TFPI对外源性凝血的调控不足是DVT发生的重要原因。重组人TFPI1-161（即缺乏K3和C末端的TFPI）在治疗兔颈静脉血栓时，有着与肝素同样的效力，但出血等不良反应明显减少15。因此，TFPI

17、有可能取代肝素应用于术后DVT的预防和治疗。5.3  TFPI与感染性疾病  血液高凝状态与炎症反应是感染性疾病的两大病理特征，常导致病情恶化甚至引发多功能脏器衰竭，从而直接威胁患者的生命，因此抗凝抗炎在严重感染性疾病的治疗中越来越受到人们的重视。动物实验发现，TFPI 能够显着改善严重感染动物的症状并提高其存活率6，16。国外对重组人TFPI（recombinant TFPI，rTFPI）治疗败血症（sepsis）进行了一系列的临床研究。期临床试验证实健康志愿者在接受 rTFPI 注射后表现出很好的耐受性，期临床试验中治疗组 28 天死亡率相对安慰剂组降低约 20%，同时

18、也显示出一定的抗炎作用。尽管期临床试验的结果不如期理想，但仍发现 rTFPI 能显着降低轻度败血症患者28天的死亡率（12% vs 22.9%）。目前对 rTFPI 治疗败血症的期临床试验方案的设计存在争议，因此 rTFPI 在败血症治疗中的作用有待于进一步研究17。         社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）是一种多发性感染性疾病，尽管使用了足量的抗生素，但病情严重的患者死亡率仍然很高。TF 在肺部的高表达与高凝状态及炎症反应密切相关，因此 TFPI 有望成

19、为控制严重肺炎的药物。目前，由 Chiron 公司推出的 rTFPI 治疗严重社区获得性肺炎的 期临床试验正在进行当中18。5.4  TFPI与恶性肿瘤  许多恶性肿瘤，如结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、胰癌等，都伴有不同程度的凝血功能紊乱，该现象称为特鲁索综合征（Trousseau syndrome），发生机制尚不清楚。研究发现许多肿瘤细胞表面都有 TF 的高表达，因此有学者推测可能是肿瘤细胞膜表面的 TF 脱落到血液中，引起患者出现高凝状态。TF 不仅与恶性肿瘤的高凝有关，它还可以作为膜表面的受体分子与其配体 Fa 结合，引起细胞内信号转导，从而导致肿瘤细胞的行为发生改变1

20、9。有研究表明 TF 可以促进肿瘤的侵袭转移及血管生成，而这种效应与凝血作用无关。TFPI 同样也可以抑制由 TF/Fa 引起的非凝血效应。Todd 给接种了黑色素瘤细胞的老鼠注入人 TFPI，发现肿瘤生长、血管生成受到明显抑制20。此外，Amirkhosravi 用老鼠动物模型证实皮下注射鼠源 TFPI 可以显着抑制黑色素瘤的侵袭转移；将稳定转染了 TFPI 基因的黑色素瘤细胞注入老鼠后，其侵袭性明显下降21。随着 TF 和 TFPI 在肿瘤发生发展中作用机制日见阐明，TFPI 有可能在将来的肿瘤治疗中发挥一定的作用。5.5  TFPI 与其他疾病  有学者发现特异性肺间

21、质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）患者的支气管肺泡灌洗液中存在大量的TF和TFPI，而且它们的水平与 IPF 病情呈正相关。免疫组织化学显示TF和TFPI在增生的立方形柱状上皮细胞上有高表达，但它们之间的不平衡促使局部形成高凝环境，从而导致纤维蛋白在肺间质的沉积22。成人呼吸窘迫综合征（adult respiratory distress syndrome，ARDS）是另一种与纤维蛋白在肺部沉积相关的疾病，研究发现TF在该疾病中同样有高表达，而TFPI水平正常或轻度升高，TFPI对TF的调控不足可能与ARDS的发展有关23。另外，还发现 TFPI 在

22、肾病综合征、1型糖尿病早期患者的血浆中有较高水平；胎盘早剥的子宫肌层、胎盘24也有较高水平的TF及TFPI表达；系统性红斑狼疮、白塞氏病血浆中游离型和总 TFPI 均降低。TF与TFPI水平的变化可能为这些疾病的诊断和治疗提供一些有用的依据。6  展望在对 TFPI 生理学基础及分子生物学特性有了深度认识的今天，人们逐步将研究的重点转移到该分子与临床疾病的关系上。许多疾病与 TFPI 表达降低或缺少有关，加入外源性 TFPI 可以不同程度地改善疾病状况。其中，在血栓性疾病、感染性疾病治疗和血管再狭窄的预防等方面已有大量的动物实验甚至临床试验，因此 TFPI 也正在向临床新药的方向快速

23、发展。尽管目前人们已经可以通过基因工程的方法获得大量重组的人TFPI，但是过短的半衰期成为临床应用的瓶颈。近期，我们实验室研制的重组长效TFPI已获成功25，该突变体的半衰期为野生型的4倍，有望为 TFPI 的临床应用提供更加广阔的空间。【参考文献】1  Bajaj MS，Tyson DR，Steer SA，et al.Role of GATA motifs in tissue factor pathway inhibitor gene expression in malignant cells.Thromb Res，2001，101(3)：203-211.2  Piro

24、O，Broze GJ Jr.Role for the Kunitz-3 domain of tissue factor pathway inhibitor-alpha in cell surface binding circulation.Circulation，2004，110(23)：3567-3572.3  Genmin Lu，George J Broze，Jr Sriram Krishnaswamy. Formation of factors IXa and Xa by the extrinsic pathway：differential regulation by tiss

25、ue factor pathway inhibitor and antithrombin III.J Biol Chem，2004，279(17)：17241-17249.4  Hans Tapper，Heiko Herwald. Modulation of hemostatic mechanisms in bacterial infectious diseases.Blood，2000，96(7)：2329-2337.5  Hugo ten Cate.Pathophysiology of disseminated intravascular coagulation in

26、sepsis.Crit Care Med，2000，28(9 Suppl)：S9-11.6  Matyal R，Vin Y，Delude RL，et al.Extremely low doses of tissue factor pathway inhibitor decrease mortality in a rabbit model of septic shock.Intensive Care Med，2001，27(8)：1274-1280.7  Park CT，Creasey AA，Wright SD.Tissue factor pathway inhibitor blocks cellular effects of endotoxin by binding to endotoxin and interfering with transfer to CD14.Blood，1997，89(12)：4268-4274.8  Tsutomu Hamuro，Yu-ichi Kamikubo，Yo Nakahara，et al.Human recombinant tissue factor pathway inhibitor induces apoptosis in cultured hum