神经行为与不同铅暴露水平新生儿脐血中脑源性神经生长因子含量的相关性研究要点

1、·论著·神经行为与不同铅暴露水平新生儿脐血中脑源性神经生长因子含量的相关性研究任丽华穆秀英陈红艳杨红丽祁葳【摘要】目的探讨铅暴露新生儿脐血中脑源性神经生长因子(BDNF与新生儿神经行为评分(NBNA之间的相关性。方法采用单纯随机法选择20112012年于太原市某医院足月顺产的新生儿,采集新生儿脐血,纳入脐血铅含量0.48mol/L的男、女婴各30名,作为高铅暴露组,共60名;将脐血铅含量<0.48mol的新生儿纳入低铅暴露组,并按照性别构成、孕周、体重、身长和头围与高铅暴露组进行配对,最终纳入60名。采用石墨炉原子吸收分光光度法检测血铅水平,新生儿20项神经行为检查法

2、检查新生儿神经行为发育状况,ELISA法检测脐血血浆中脑源性神经生长因子的含量。比较两组新生儿脐血BDNF含量以及NBNA得分,并将血铅水平与BDNF、BDNF与新生儿NBNA得分进行直线相关性分析。结果高铅暴露组脐血铅含量为(0.613±0.139mol/L,高于低铅暴露组脐血铅含量的(0.336±0.142mol/L(t=3.21,P<0.001。高铅暴露组新生儿NBNA总分(36.35±1.86分、主动肌张力得分(6.90±0.27分和一般评估得分(5.93±0.32分低于低铅暴露组分别为(38.13±0.96分、(7.7

3、9±0.35分、(6.00±0.00分,t值分别为8.21、10.23、2.32,P值分别为<0.001、<0.001、0.037。高铅组新生儿脐血中BDNF含量(3.538±1.203ng/ml高于低铅组(2.464±0.918ng/ml(t=7.60,P<0.001。相关性分析发现,脐血中BDNF含量与神经行为总分、被动肌张力、主动肌张力得分均呈负相关(r值分别为-0.27、-0.29、-0.30,P值均<0.001。结论脐血铅暴露可引起新生儿神经行为损害,引起脐血BDNF含量增加,可能可以作为铅引起新生儿神经行为损害的生物标

4、志物。【关键词】铅中毒,神经系统;脑源性神经营养因子;神经行为测试;脐血Prenatal lead exposure related to cord blood brain derived neurotrophic factor(BDNFlevels andimpaired neonatal neurobehavioral development Ren Lihua,Mu Xiuying,Chen Hongyan,YangHongli,Qi Wei.Department of Prevention and Health Care,Shanxi People's Hospital,Tai

5、yuan030012,ChinaCorresponding author:Ren Lihua,Email:rlh1205【Abstract】Objective To explore the relationship between umbilical cord blood brain-derived neurotrophic factor(BDNFand neonatal neurobehavioral development in lead exposure infants.Methods All infants and their mother were randomly selected

6、 during2011to2012,subjects wereselected according to the umbilical cord blood lead concentrations,which contcentration of lead was higherthan0.48mol/L were taken into high lead exposure group,about60subjects included.Comparing to thehigh lead exposure group,according to gender,weight,pregnant week,l

7、ength and head circumferenece,thelevel of cord blood lead concentration under0.48mol/L were taken into control group,60cases included.Lead content was determined by graphite furnace atomic absorption spectrometry.Neonatal behavioral neurological assessment(NBNAwas used to determine the development o

8、f neonatal neuronal behavior.The content of BDNF was detected by ELISA.Comparing the BDNF and the NBNA score between twogroups,and linear correlation was given on analysis the correlation between lead concentration in cordblood and BDNF,BDNF and the NBNA score.Results Lead content in high exposure g

9、roup was(0.613±0.139mol/L,and higher than(0.336±0.142mol/L in low exposure group(t=3.21,P<0.001.NBNAsummary score(36.35±1.86,active muscle tension score(6.90±0.27and general assessment score(5.93±0.32in high exposure group were lower than those(38.13±0.96,7.79±0

10、.35,6.00±0.00in low exposuregroup(t values were8.21,10.23,2.32,respectively,P values were<0.001,<0.001and0.037.BDNFcontent in high exposure group which was(3.538±1.203ng/ml was higher than low exposure group(2.464±0.918ng/ml(t=7.60,P<0.001.The correlation analysis found that

11、the cord blood BDNF content wasDOI:10.3760/cma.j.issn.0253-9624.2016.06.008作者单位:030012太原,山西省人民医院预防保健处通信作者:任丽华,Email:rlh1205negatively correlated with NBNA summary score,passive muscle tension and active muscle tone score(r was-0.27,-0.29,-0.30,respectively,P values were<0.001,respectively.Conclus

12、ion Prenatal lead exposure results poor neonatal neurobehavioral development and cord blood BDNF was negatively correlated with neonatal neurodevelopment,may serve as a useful biomarker.【Key words】Lead poisoning,nervous system;Brain-derived neurotrophic factor;Neonatal behavioral neurological assess

13、ment;Cord blood铅是一种对人体危害极大的有害重金属,广泛存在于环境与职业暴露中,可对机体多个系统、器官产生损伤作用,同时,铅对神经系统具有强的亲和性1,易对神经系统造成损害。铅可通过单纯扩散或者与钙竞争钙离子通道经胎盘屏障而进入胎儿循环系统,导致未发育成熟大脑的血脑屏障通透性增强,通过脑内皮细胞的胞饮作用摄入大量的铅2。胎儿期是人类神经系统生长发育最为迅速的阶段,有研究表明,铅暴露对胎儿及儿童神经系统的影响没有最低阈值,即使极低水平的铅暴露也会导致儿童神经行为方面的缺陷3。脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF在脑组织中高

14、度集中分布,不仅能促进神经干细胞的增殖和分化,还能维持正常神经元的功能,并对损伤的神经元进行修复。脑组织中的BDNF可以通过血脑屏障进入血液4-12。但是该结论尚且缺乏足够的证据支持,因此,在本研究中,通过人群研究对太原市某医院的铅暴露的孕妇脐血中BDNF含量与新生儿20项神经行为评分(neonatal behavioralneurological assessment,NBNA之间的关系进行研究,以期为铅暴露水平对新生儿神经损伤提供依据。对象和方法1.对象:采用单纯随机法随机选择20112012年于太原市某医院足月顺产的新生儿,测量新生儿脐血血浆铅含量,纳入脐血铅含量0.48mol/L的男、

15、女婴各30名为高铅暴露组13,共60名;同一时期,将脐血铅含量<0.48mol的新生儿纳入低铅暴露组,并按照性别构成、孕周、体重、身长和头围与高铅暴露组进行配对,最终纳入新生儿60名。排除早产、难产的新生儿,有严重黄疸的新生儿,有新生儿窒息症状、脑膜炎及脑外伤等影响智力的疾病以及其他严重的全身性、肝、肾性及代谢性疾病的新生儿。并在孕妇分娩当日采集孕妇静脉血。本研究获得山西省人民医院伦理委员会批准(批号: 2014省医伦审5号。所有研究对象及其监护人签署知情同意书后,进行生物样本的采集和测试。2.试剂及仪器:BDNF ELISA试剂盒、ABC工作液、TBC显色液(武汉博士德生物工程有限公司

16、,酶标仪(美国Becton-Dickin-Son公司, CEM-MARS5微波消解仪(美国CEM公司,石墨炉原子吸收光谱仪(美国Thermo elemental公司。3.实验方法:(1血铅含量的测定:在孕妇分娩时采集孕妇静脉血和新生儿脐血各5ml,肝素抗凝管之后于-20保存。测定时取200l血样,加入0.1mol/L的稀硝酸3ml,混匀后放置过夜,加入体积分数为0.1的三氯醋酸300l,900×g离心15min,取上清液于石墨炉原子吸收法测定血铅含量。采用国家全血标准物质进行标准曲线绘制,实验精密度相对标准偏差小于5%,加标回收率大于90%5。(2新生儿神经行为发育评价:本研究中采用

17、我国鲍秀兰4修订的新生儿20项神经行为检测法,对出生后3d以内的新生儿的头围、体重、身长以及神经行为进行评价,其中包括对外界环境和外界刺激的适应性、被动肌张力、主动肌张力、原始反射和一般反应5个方面。根据反应程度的不同,分为0、1和2分3个等级,以总分>35分为合格。(3脐血血浆中BDNF含量的测定:将采集到的脐血转移至5ml离心管中,900×g离心15min,采用吸管将分离出来的血浆转移至离心管中于-80低温冰箱保存。按照BDNF Elisa试剂盒说明制备好标准品各浓度稀释液。将待测血浆适当倍数稀释后加入包被有BDNF抗体的酶标中,37反应90min后去除液体。每孔加入生物素

18、抗人BDNF抗体工作液100l, 37反应60min。PBS洗涤三次。每孔加入ABC 工作液100l,37反应30min。PBS洗涤5次。每孔加入90l已在37平衡30min的TMB显色液,37避光反应20min。每孔加入100l TMB 终止液。除去孔内气泡,用酶标仪在450nm读取每孔吸光度值(A值,根据标准品A值绘制曲线,根据样品稀释倍数求得待测血浆样本中BDNF 含量。4.统计学方法:数据录入采用Epidata3.0软件,应用SPSS13.0统计软件进行分析,两组孕妇年龄、体重、静脉血铅含量以及新生儿体重、身长、头围、脐血中的铅含量、BDNF含量以及新生儿NBNA 得分符合正态分布,以

19、x±s表示,采用t检验进行分析。对血铅与BDNF、BDNF与新生儿NBNA得分进行直线相关性分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.高、低铅暴露组孕妇及新生儿一般情况:由表1可见,两组孕妇的年龄、体重差异没有统计学意义。两组新生儿的体重、身长、头围差异也没有统计学意义。2.不同脐血铅暴露组血铅结果:两组孕妇静脉血及新生儿脐血血铅的含量见表2。高铅组与低铅组血铅含量的差异有统计学差异。进行相关分析后发现,孕妇静脉血与新生儿脐血血铅含量相关性较高(r=0.77,P<0.001。3.新生儿神经行为得分比较:在对两组新生儿进行20项神经行为检测发现,低铅暴露组60名新生儿

20、中无不达标新生儿;而高铅暴露组中有1个未达正常标准(35分。具体各项指标的比较见表3。在对两组新生儿的20项神经行为检查中,高铅暴露组新生儿的总分高于低铅组,且两组新生儿在NBNA总分、主动肌张力、一般评估得分之间的差异均有统计学意义(P<0.05。4.脐血BDNF含量比较:高铅组新生儿脐血中BDNF含量为(3.538±1.203ng/ml,高于低铅组的(2.464±0.918ng/ml,两组BDNF含量差异有统计学意义(t=7.60,P<0.001。进而对脐血铅浓度和脐血BDNF水平进行分析,得到r=0.286,P<0.001,存在直线相关关系,随着脐血

21、铅浓度增加,BDNF水平有增高趋势。5.脐血中BDNF含量与新生儿神经行为得分的相关性分析:通过对脐血中BDNF含量与新生儿神经行为得分进行相关性分析发现,新生儿脐血中BDNF含量与NBNA总分、被动肌张力,主动肌张力和一般评估得分均呈负相关,见表4。且与主动肌张力得分的相关性>与被动肌张力得分的相关性>与NBNA总分的相关性>与一般评估得分的相关性。进一步对高铅暴露组脐血中BDNF含量与新生儿神经行为指标进行了相关分析,结果表明:高铅暴露组新生儿脐血中BDNF含量与神经行为总分、被动肌张力、主动肌张力和一般评估得分也呈负相关,见表5。表2两组新生儿脐血铅及孕妇静脉血含量比较

22、(mol/L,x±s组别低铅暴露组高铅暴露组t值P值人数6060新生儿脐血0.336±0.1420.613±0.1393.21<0.001孕妇静脉血0.401±0.2930.622±0.3612.18<0.001讨论铅是一种可以对发育期神经系统产生损伤的神经毒物,可对中枢神经系统多个神经化学通路、血脑屏障、突触、髓鞘和儿茶酚胺代谢造成损伤,又因胎儿和儿童期神经系统相对不发达,环境中的铅暴露可对其认知功能造成严重影响。有研究表明血铅水平每上升0.1g/L,学龄期儿童的智商会下降0.91分7,并且已有不少研究证实了孕期铅暴露与新生儿神经

23、行为发育之间的关系8-9。胎儿体内的铅主要是通过母体与胎体之间的胎盘转运而来,有研究发现,铅经胎盘转运最早可在妊娠第12周发生,此后胎儿体内的铅负荷呈增长趋势10。在本研究中,研究者通过对母体静脉血和新生儿脐血之间的研究发现它们存在高度的相关,且脐血血铅含量约为母体血铅含量的80%,也间接证明了母体和胎儿之间存在铅转运。由于出生前后的胎儿本身的发育特点,其血脑屏障发育尚不完善,使其对外源性化学毒物特别敏感,而铅又易于通过血脑屏障而沉积在脑中,影响正常的脑发育和脑功能。因此可以认为没有一个绝对安全的铅暴露范围。本研究发现,铅暴露可对表1两组孕妇及新生儿一般情况比较(x±s组别低铅暴露组

24、高铅暴露组t值P值人数6060孕妇年龄(岁27.72±5.9428.10±3.970.420.733孕妇生产时体重(kg71.97±9.1773.26±9.730.740.640新生儿体重(kg3.53±0.373.40±0.401.890.058新生儿身长(cm48.68±2.2447.93±2.101.880.080新生儿头围(cm34.77±1.2034.48±1.501.160.203表4两组新生儿脐血BDNF 含量与NBNA 得分相关性分析项目NBNA 总分行为能力被动肌张力主动肌张力

25、原始反射一般评估r 值-0.27-0.09-0.29-0.30-0.06-0.18P 值<0.0010.172<0.001<0.0010.2680.038注:NBNA:新生儿神经行为评估;BDNF :脑源性生长因子表5高铅暴露组新生儿脐血BDNF 含量与NBNA 得分相关性分析项目NBNA 总分行为能力被动肌张力主动肌张力原始反射一般评估r 值-0.39-0.10-0.37-0.30-0.10-0.20P 值<0.0010.076<0.001<0.0010.2580.046注:NBNA:新生儿神经行为评估;BDNF :脑源性生长因子新生儿神经发育行为产生损伤

26、,这与以往研究结果一致11-12。有研究发现,脐血铅含量低于0.32mol/L时,新生儿已能表现出一定的神经发育损伤效应12。而本研究采用0.48mol/L 作为划分低铅和高铅暴露组的界限,是因为有研究表明以此水平为界两组在新生儿NBNA 方面的差异有统计学意义14。BDNF 主要在中枢神经系统中表达,广泛分布于海马、皮质和杏仁核等部位,BDNF 可以通过靶源性、自分泌、旁分泌方式与神经细胞上高亲和力受体p75结合,激发各种信号传导通路而发挥其特殊的生物作用14。不仅能促进神经干细胞的增殖迁移,还能促进突触的可塑性,参与学习的可塑性和长时程增强效应,对学习记忆功能起重要作用15-16。目前大多

27、数研究显示铅通过抑制发育中脑BDNF 的转录、翻译和转运17-18,降低实验动物的学习能力,也有学者发现铅可增加大鼠脑中BDNF 的表达19-20,拮抗铅的毒性作用。目前尚未见铅对脐血血浆BDNF 影响的报道,有研究表明胎盘有BDNF 及其受体表达21,胎盘与胎儿神经发育关系密切,本研究发现高铅暴露组新生儿脐血血浆BDNF 含量明显高于低铅暴露组,这可能与高铅组胎盘或者新生儿神经系统在胚胎发育时受到铅的毒性损伤,BDNF 应激性升高而提供一定保护作用22。本次研究发现BDNF 与新生儿神经行为评价中的3项有相关性,而且和NBNA 总分也有相关性,说明随着新生儿脐血中BDNF 含量的增高,NBN

28、A 评分下降。脐血BDNF 可以作为新生儿神经发育损害的标志物。以上研究结果表明,孕期铅暴露会对新生儿神经行为能力产生不良影响,胎儿脐血中BDNF 含量明显增高,与神经行为呈负相关,可能作为新生儿神经发育损害的标志物。但是由于BDNF 本身的复杂性以及本次研究尚无法说明BDNF 含量与新生儿神经行为能力下降程度之间的关系,因此脐血BDNF 在铅所致新生儿神经发育中的作用有待于进一步探讨。参考文献1Mason LH,Harp JP,Han DY.Pb neurotoxicity:neuropsychological effects of lead toxicityJ.Biomed Res Int

29、,2014,2014:840547.DOI:10.1155/2014/840547.2Lin CM,Doyle P,Wang D,et al.The role of essential metals in the placental transfer of lead from mother to childJ.Reprod Toxical.2009,29:443-446.DOI:10.1016/j.reprotox.2010.03.004.3Dapul H,Laraque D.Lead poisoning in childrenJ.Adv Pediatr,2014,61(1:313-333.D

30、OI:10.1016/j.yapd.2014.04.004.4鲍秀兰.新生儿行为能力和测查方法J.实用诊断与治疗杂志,2003,17(6:441-443.DOI:10.3969/j.issn.1674-3474.2003.06.001.5中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.GB/T22554-2010基于标准样品的线性校准S.北京:中国标准出版社,2012.6Fernandes BS,Molendijk ML,Köhler CA,et al.Peripheral brain -derived neurotrophic factor (BDNFas a b

31、iomarker in bipolar disorder:a meta -analysis of 52studiesJ.BMC Med,2015,13:289.DOI:10.1186/s12916-015-0529-7.7Carlisle JC,Dowling KC,Siegel DM,et al.A blood lead benchmark for assessing risks from childhood lead exposure J.J Environ Sci Health A Tox Hazard Subst Environ Eng,2009,44(12:1200-1208.DOI

32、:10.1080/10934520903139829.表3两组新生儿NBNA 得分比较(x ±s 组别低铅暴露组高铅暴露组t 值P 值人数6060NBNA 总分38.13±0.9636.35±1.868.21<0.001行为能力11.35±0.6211.18±0.711.820.078被动肌张力7.86±0.237.63±0.291.710.081主动肌张力7.79±0.356.90±0.2710.23<0.001原始反射5.82±0.545.83±0.620.810.47

33、1一般评估6.00±0.005.93±0.322.320.037注:NBNA:新生儿神经行为评估8Hu H,Téllez-Rojo MM,Bellinger D,et al.Fetal lead exposureat each stage of pregnancy as a predictor of infant mentaldevelopmentJ.Environ Health Perspect,2006,114(11:1730-1735.9潘丽明,黄庆生,许勇.子宫内低铅暴露对婴儿早期神经行为影响的研究J.广东微量元素科学,2009,16(4:41-44.DO

34、I:10.3969/j.issn.1006-446X.2009.04.005. 10谢军,候茹兰,李劲松.铅对胎儿,婴幼儿脑和智力发育的影响J.中国公共卫生,2001,18(11:1397-1399 11Liu J,Chen Y,Gao D,et al.Prenatal and postnatal leadexposure and cognitive development of infants followed overthe first three years of life:a prospective birth study in thePearl River Delta region,

35、ChinaJ.Neurotoxicology,2014,44:326-334.DOI:10.1016/j.neuro.2014.07.001. 12Liu J,Gao D,Chen Y,et al.Lead exposure at eachstage of pregnancy and neurobehavioral development ofneonatesJ.Neurotoxicology,2014,44:1-7.DOI:10.1016/j.neuro.2014.03.003.13李洪钧,陈宁君,吴妙英.孕中期铅暴露对婴儿神经行为发育影响的研究J.黑龙江医学,2009,33(6:415-4

36、17.DOI:10.3969/j.issn.1004-5775.2009.06.003.14叶萍,孙玲,白建桥,等.脐血铅含量与新生儿神经行为发育的关系J.武汉科技大学学报(自然科学版,2001,24(4:421-424.DOI:10.3969/j.issn.1674-3644.2001.04.027. 15Lu B,Nagappan G,Guan X,et al.BDNF-based synapticrepair as a disease-modifying strategy for neurodegenerativediseasesJ.Nat Rev Neurosci,2013,14(6:

37、401-416.DOI:10.1038/nrn3505.16Leal G,Afonso PM,Salazar IL,et al.Regulation ofhippocampal synaptic plasticity by BDNFJ.Brain Res,2015,1621:82-101.DOI:10.1016/j.brainres.2014.10.019.17Stansfield KH,Pilsner JR,Lu Q,et al.Dysregulationof BDNF-TrkB signaling in developing hippocampalneurons by Pb(2+:implications for an environmentalbasis of neuro