基因修饰骨髓细胞移植后重建造血的实验观察

1、基因修饰骨髓细胞移植后重建造血的实验观察【摘要】目的探索利用基因标记技术观察造血重建的生物学特征。方法利用脂质体介导将新霉素抵抗(NeoR)基因转导进入小鼠骨髓细胞。然后移植给受致死量照射的同种小鼠。观察受体小鼠造血的重建，并对造血重建后受体鼠的脾及骨髓细胞进行标志基因的检测。结果移植小鼠健康存活，并形成脾结节。而未经输注的对照鼠则很快死于骨髓衰竭。同时，移植鼠的部分脾及骨髓细胞于G418体系中能够存活，经聚合酶链反应(PCR)检测含有NeoR基因片段。结论基因修饰骨髓细胞能够成功地重建造血，并在一定程度上稳定地表达外源基因。【关键词】骨髓细胞基因转移移植 Experimental studi

2、es on hematopoiesis reconstitution by using of transplantation of gene-modified bone marrow cells.ZOU Ping, LU Huazhong.Institute of Hematology, Tongji Medical University, Wuhan 430022【Abstract】ObjectiveTo explore the biological features of hematopoiesis reconstitution by using genetic marking.Metho

3、dsNeoR gene was transduced into bone marrow (BM) cells of mouse mediated by liposome. Then these cells were transplanted into lethally irradiated recipients. The hematopoiesis reconstitution was observed and the marker gene in spleen and BM cells of recipients after hematopoiesis reconstitution was

4、examined.ResultsThe transplanted recipients remained alive and healthy. But the irradiated mice with no transplantation died from BM aplasia soon. Meanwhile, the cells from spleen and BM of transplanted mice could be alive in G418 system, and contained the DNA fragments of NeoR gene by PCR. Conclusi

5、onGene-modified BM cells could be used to reconstitute hematopoiesis successfully and express the foreign gene to some extent stably.【Key words】Bone marrow cellGene transferTransplantation本文利用脂质体介导的基因转移策略将新霉素抵抗(NeoR)基因转导进入小鼠骨髓细胞。然后，移植给受致死量照射的同种小鼠。旨在探讨利用脂质体介导的基因标志技术观察造血重建的生物学特征的可能性，为进一步临床应用提供依据。材料与方法

6、一、材料1.质粒：pKo-neo为NeoR60Co线。5.引物：上海生物工程公司合成。用于NeoR基因的扩增，扩增产物为131bp。引物序列为：5-ATCATGGCTGATGCAATGCG-35-AGATCATCCTGATCGACAAG-36.分子量标准：PBR322/Haemarker为Gibco产品。二、方法1.质粒的转化、扩增、纯化与酶切鉴定：按常规方法进行1。2.供体小鼠骨髓细胞的制备与培养：颈椎脱臼法处死小鼠。75%酒精消毒鼠体。取后肢，用RPMI1640冲出骨髓腔中骨髓细胞，4号针头吸吐数次，调整细胞浓度至2108/L，培养于RPMI1640、15%小牛血清中，37、5%CO248

7、72小时。3.脂质体-质粒DNA复合物的制备：按厂家推荐方法结合本室操作常规制备。4.基因转移过程：按本室方法进行。5.受体小鼠的处理：采用60Co线照射。照射野15cm15cm，距离75cm，剂量率3Gys/829，照射时间2845，累积剂量为10Gy。6.骨髓细胞移植的操作：将照射小鼠分成3组。第1组(未输注骨髓细胞对照组)：照射后不移植骨髓细胞。第2组(输注未转导骨髓细胞组)：照射后4小时内移植未经基因转移的骨髓细胞，作为对照。第3组(输注转导骨髓细胞实验组)：于照射后4小时内经尾静脉输注基因转导骨髓细胞0.2ml(2108/L)。尾静脉注射方法参照文献执行2。7.脾结节的观察：参照文献

8、方法2。8.G418选择培养：于RPMI1640、15%小牛血清培养体系中，加入终浓度为1g/L的G418培养造血重建后小鼠骨髓细胞，观察细胞的存活与生长情况。9.DNA的提取：参照文献方法1。10.PCR扩增：采用法国产Crocodile扩增仪。反应体系为：模板DNA0.5g，引物各0.2mol/L，dNTP各200mol/L，MgCl21.5mmol/L，Tris-Cl10mmol/L，KCl50mmol/L，TritonX-1000.1%，TaqDNA多聚酶2U，加去离子水至总体积50l。反应条件：首次94，5分钟，然后，94，45秒钟，55，45秒钟，75，1分钟，35个循环，72，5

9、分钟，4终止反应，凝胶电泳观察结果。结果一、存活情况：第1组(10只)1周内全部死亡。其存活时间分别为：3天1只，4天3只，5天3只，6天2只，7天1只。而第3组和第2组均存活直至处死取脾为止，长者达1个月。二、脾结节：第1组小鼠死亡后取脾观察均未见脾结节形成。而第2组和第3组于输注后第8天及12天处死鼠取脾，均见有脾结节形成，两组比较差异不显著。三、G418抗性集落：第2组小鼠造血重建后处死取骨髓于G418体系中培养，细胞不能存活。而第3组小鼠造血重建后分别于第15，30天处死取骨髓细胞于G418体系中培养，可见有部分细胞存活，并逐渐形成集落。集落的出现情况为：第15天，4例中3例阳性；第3

10、0天，4例中1例阳性。四、PCR扩增结果：将第2组与第3组小鼠分别于输注后第15天、30天处死取脾及骨髓细胞，提取DNA，然后，进行PCR扩增。检测是否含有NeoR基因片段。结果见附表。附表PCR扩增结果(阳性例数/总例数)组别脾细胞骨髓细胞第15天第30天第15天第30天第2组0/40/40/40/4第3组2/40/44/41/4 讨论自从1983年Joyner等3首先将NeoR基因导入小鼠骨髓细胞，开创了造血干细胞基因转移的先河之后，十多年来，以造血干细胞作为受体细胞进行的基因转移研究可谓是方兴未艾4。普遍认为，造血干细胞是基因治疗的理想靶子，一些研究业已证实通过逆转录病毒介导将外源基因导

11、入骨髓细胞，并移植到动物体内后可获得长期表达。然而，由于逆转录病毒载体难于构建，操作复杂，对处于Go期的造血干细胞转移效率低，尤其尚存安全之忧，而迟迟难以为临床所普遍认同。近年来，脂质体介导的基因转移引起人们的兴趣5，并已证实在多种细胞类型获得高的基因转移率，已成为非病毒基因转移方法中的最佳选择。我们曾报道利用脂质体介导人及小鼠造血干细胞基因转移，经体外研究，初步结果显示：利用脂质体介导在骨髓细胞可获得较高的转移，并建立了稳定的方法6，7。为进一步探讨转导细胞表达外源基因的稳定性及应用前景，本文通过体内试验对转导细胞重建造血以及造血重建后的基因表达进行了观察。结果显示，受致死量照射小鼠经移植转

12、导细胞后能够存活，并形成脾结节。而未移植鼠则很快死亡。死亡后取脾观察无脾结节形成。移植转导细胞小鼠存活后，分别于移植后的第15天、第30天处死取骨髓细胞进行体外培养，观察到移植转导细胞组小鼠重建造血后部分骨髓细胞于G418体系中能够存活，提示其表达NeoR基因，但表达效率尚低。而移植未转导细胞，小鼠造血重建后骨髓细胞于G418体系中则不能存活。同时，经PCR扩增检测脾及骨髓细胞染色体基因组中NeoR基因的存在情况。结果显示，移植未转导细胞组全部阴性，而移植转导细胞组小鼠脾及骨髓细胞中均部分存在NeoR基因。但在脾细胞与骨髓细胞中NeoR基因的存在情况不一致。考虑可能由于转导细胞输注后在体内随机

13、分布的结果，也可能与转导细胞表达稳定性的不一致有关。此外，在G418抗性集落与PCR检测结果之间也不存在平行关系，例如，第15天骨髓细胞抗性集落4例中出现3例阳性。而PCR检测则4例全部阳性。可能由于NeoR基因部分不表达或表达水平低所致。综上所述，采用脂质体介导的基因转移方法转导造血干细胞可获得有效的基因转移，转导骨髓细胞能够成功地重建体内造血，不会因为基因转导而影响其活性。移植后可在小鼠体内形成脾结节。与未转导骨髓细胞之间无显著性差异。造血重建后，部分脾及骨髓细胞仍存在或表达外源基因。提示，外源基因已整合进入宿主基因组，并在一定程度上稳定表达。部分细胞的表达可持续一个月，至于更长时间的表达

14、有待进一步的探讨。本课题为卫生部科学研究基金资助(资助号：320.2430-330)作者单位：430022武汉，同济医科大学血液病学研究所参考文献1Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989.50-522唐佩弦，杨天楹.造血细胞培养技术.第1版.西安：陕西科学出版社，1985.90-923Joyner A, Keller G, Phillips RA, et al. Retrovirus transfer of a bacterial gene into mouse haematopoietic progenitor cells. Neture, 1983, 305:556-560.4Nienhuis AW. Gene transfer into hematopoietic stem cells.