微生物鉴定中常用的生理生化反应

1、微生物鉴定中常用的生理生化试验 郭森 09级生命基地 200900140029 周二下午 第五排摘要：本次实验包括大分子水解试验、糖发酵试验和IMViC试验（吲哚、甲基红试验）三类试验，根据要求本实验使用六种培养基分别对所需菌种组合进行了大约24h的培养，之后按照实验要求进行各个试验。最后基本上观察到了实验现象，了解了所用菌种鉴别的方法和原则。关键词：微生物鉴定；生理生化试验；大分子水解试验；糖发酵试验；IMViC试验前言：不同种类的微生物有着不同的代谢类型，例如对一些物质的分解能力及分解代谢的产物的不同反映出他们不同的生理特征，这些特征可以用来对不同种类微生物进行鉴定和分类。因此可以对微生物

2、的不同生化反应进行试验，以此证明微生物生理特征的多样性，证明微生物分类鉴别的依据。生理生化试验相比其他鉴别方法而言相对简便、快捷、经济实用，在一般的实验室中都可以进行，因此在微生物种类的初步鉴别中被广泛使用。1 材料和方法材料菌种 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，大肠杆菌（Esherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），普通变形菌（Proteus vulgaris），铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。 培养基 固体淀粉培养基，固体油脂培养基，

3、葡萄糖发酵培养基，乳糖培养基，蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。 溶液和试剂 卢戈式碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂等。 1.1.4仪器和其他用品 无菌平板，无菌试管，接种环，接种针和试管架等。方法制作培养基.1淀粉培养基 和5g琼脂放入300ml蒸馏水中加热融化，最后总体积在250ml左右，121灭菌20min。 .2油脂培养基 先分别取琼脂和300ml蒸馏水加热融化，然后再分别取3g蛋白胨、1.5g牛肉膏、1.5g NaCl加热，调节pH至7.2，然后再加入 0.3ml 1.6%中性红水溶液。分装时，不断搅拌，使油脂均匀分布于培养基中，121灭菌20min。 .3糖发酵培养基（葡萄糖

4、和乳糖） 取300ml蛋白胨水培养基、0.30.6ml1.6%溴甲酚紫乙醇溶液混合并调节pH至7.6，另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖等）每管各10ml（1）将含指示剂的蛋白胨水培养基（pH7.6）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管（Durham tube），使充满培养液。（2）将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别121灭菌20min。（3）灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液（葡萄糖和乳糖）0.5ml（浓度约为1%）。 .4蛋白胨水培养基 取3g蛋白胨、1.5g NaCl加入到约300ml蒸馏水中加热混合，调节pH至7.6，然后121灭菌20min。 .5葡萄糖蛋白胨

5、水培养基 取1.5g蛋白胨、1.5g葡萄糖和0.6g KHPO溶于1000ml水中，调节pH至7.07.2，过滤。分装试管，每管10ml，121灭菌20min。大分子水解试验 .1淀粉水解试验（1）将固体培养基熔化后冷却至50左右，无菌操作成平板；（2）用记号笔在平板底部划成4部分；（3）将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在4部分写上菌名；（4）将平板倒置在37恒温箱中培养24h；（5）观察各种细菌的生长状况，打开平板盖子，滴入少量卢戈式碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。 .2油脂水解试验（1）将熔化的固体油脂培养

6、基冷却至50 左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平板，待凝；（2）用记号笔在平板底部划成4部分，分别在4部分标上菌名；（3）用无菌操作将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别划十字线接种于平板的相对应部分的中心；（4）将平板倒置，37温箱中培养24h；（5）取出平板，观察菌苔颜色。1.2.3糖发酵试验（1）用记号笔在各试管外壁上分别标明发酵培养基的名称和所接种的细菌菌名；（2）取葡萄糖发酵培养基3支，分别接入大肠杆菌、普通变形菌，第三支不接种，作为对照。另取乳糖发酵培养基试管3支，同样分别接入大肠杆菌、普通变形菌，第三支不接种，作为对照。接种后，轻轻摇动试管，使其

7、均匀，防止倒置的小管进入气泡。（3）将接过种和作为对照的6支试管均置于37中培养2448h。（4）观察各试管颜色变化及德汉式小管中有无气泡。 IMViC试验 .1接种与培养用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基和两支葡萄糖蛋白胨水培养基，置37培养48h。 .2结果观察（1）吲哚试验：于培养48h后的蛋白胨水培养基内加入34滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。（2）甲基红试验：培养48h后，将1支葡萄糖蛋白胨水培养基培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变为红色者为阳性，变为黄色者为阴性。2 结果

8、与分析2.1 实验结果大分子水解试验（见表1）（1）淀粉水解试验：经过48h的培养后，打开培养皿，往培养皿中滴入少量卢戈氏碘液，并使其旋转均匀后，可以观察到，枯草芽孢杆菌周围有一条无色透明环，宽约3mm，而铜绿芽孢杆菌周围也有一透明无色小环，宽度较小，可知枯草芽孢杆菌为阳性，铜绿芽孢杆菌亦为阳性，只是比枯草芽孢杆菌较弱；（2）油脂水解实验：经过同上培养48h后，在油脂培养基上可以观察到接种的铜绿假单胞菌周围呈现深红色斑点，颜色明显深于周围且培养基变的比周围薄，可知铜绿假单胞菌为阳性。 糖发酵试验（见表2）（1）葡萄糖发酵试验：经过48h的培养后，可以观察到，两支试管均变为黄色，葡萄糖发酵培养基

9、试管中，接种大肠杆菌和普通变形菌的试管内的德汉式小管内都有气泡，且前者气泡的大小约为后者的四倍，对照组没有气泡产生也未变色；（2）乳糖发酵试验：经过同上培养后，可以观察到，乳糖培养基试管中，只有培养大肠杆菌试管中的德汉式小管有气泡产生并变为黄色，且量与葡萄糖发酵培养基中的普通变形菌产气差不多，该组普通变形杆菌及对照组均未出现气泡均为变色。IMViC试验（见表3） （1）吲哚试验：经过48h的培养后，按要求向接种两菌的蛋白胨水培养基内加入34滴乙醚并摇动数次后静置1min，之后乙醚上升并形成一大致12mm厚的乙醚层，然后沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂后，观察到接种大肠杆菌的试管中乙醚层与培养基层中

10、呈现浅红色，接种产气肠杆菌的看不出红色或者是呈褐色；（2）甲基红试验：经过同上培养后，向接种两菌的葡萄糖蛋白胨培养基培养物中加入甲基红试剂2滴，接种大肠杆菌的呈现较深粉红色，产气杆菌呈黄色，可见大肠杆菌为阳性，产气杆菌为阴性。 图1 乳糖发酵试验结果图 图2 甲基红试验结果图 图3 淀粉水解试验结果图图4 葡萄糖糖发酵试验结果图 图5 吲哚试验结果图 图6 油脂水解试验结果图表1 大分子水解试验结果记录表（+表示阳性；-表示阴性）菌名淀粉水解试验 油脂水解试验 枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌+-+-+ 表2 糖类发酵试验结果记录表（+，+表示产酸，产气；-，-表示不产酸，不产气

11、）糖类发酵大肠杆菌 普通变形杆菌 对照葡萄糖发酵 +，+ +, + -, -乳糖发酵 +, + -，- -, - 表3 IMViC试验结果记录表（+表示阳性；-表示阴性）菌名IMViC试验吲哚试剂 甲基红试剂 大肠杆菌产气肠杆菌对照 + - -+-2.2.1大分子水解试验微生物对大分子物质如淀粉、蛋白质和脂肪不能直接利用，必须依靠产生的胞外酶将大分子物质分解后，才能被微生物吸收利用。胞外酶主要为水解酶，通过水裂解大分子物质为较小化合物，使其能被运输到细胞内。淀粉遇碘液会变蓝，细菌周围遇碘液不变蓝色，说明细菌周围淀粉被细菌分泌的淀粉水解酶水解，可以通过观察每种菌周围透明环的有无和大小来判断细菌有

12、无分解淀粉的能力及能力的强弱；脂肪水解后产生的脂肪酸可以改变培养基的pH，使pH降低，培养集中的中性红指示剂会使培养基从淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。从实验结果中可以看出，枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌为淀粉水解试验阳性，其余三菌为淀粉水解试验阴性；铜绿假单胞菌为油脂水解试验阳性，其余三菌为油脂水解阴性。 糖发酵试验绝大多数的细菌都能以糖类作为碳源，但是其分解糖类物质的能力有很大的差异，有些细菌在分解糖类时可以产生有机酸和气体，有些只产酸或气体，或有的不产气不产酸。可通过这些菌种的生理特征来对其进行分类和坚定。当发酵产酸时，溴甲酚紫指示剂可由紫色转变为黄色，若产生气体可由德汉式小管记录。

13、因此，根据实验结果可知，大肠杆菌对葡萄糖发酵产气产酸且产气量接近普通变形杆菌的四倍，对乳糖发酵也产气产酸只是产气量少于葡萄糖发酵；普通变形杆菌对葡萄糖发酵产酸产气，但对乳糖发酵不产气也不产酸。 IMViC试验吲哚试验是用来检测吲哚的产生，有些细菌产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生吲哚和丙酮酸。吲哚对二甲苯氨基酸甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚可以作为一个生化检测的指标。由实验结果可知，大肠杆菌吲哚反应为阳性，产气肠杆菌为阴性。甲基红试剂是用来检测由葡萄糖产生的有机酸。当细菌代谢产酸时，培养基变酸，加入培养集中的甲基红指示剂由橙黄色（6

14、.3）转变为红色（4.2），即甲基红反应。尽管所有肠道微生物都能产酸，且大肠杆菌和产气杆菌在早期均能产生有机酸，但是大肠杆菌在培养后仍能维持酸性4，而产气杆菌则转化为，非酸性末端产物。因此，大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。3 小结 在进行实验时要认真按照步骤进行操作，如大分子水解试验中，滴加少量卢戈式碘液后要轻轻旋转平板使碘液均匀分布；在制作固体油脂培养基时，要注意充分摇晃并且按照顺序进行配制；在糖发酵试验接种中应轻轻摇动试管使其均匀防止倒置的小管进入气泡；吲哚试验中要注意等加入乙醚后并待其上升后再沿壁徐徐加入吲哚试剂；在甲基红试验中注意甲基红试剂不能添加太多。否则将会对实验产生很大影响。另

15、外，在进行大分子水解试验时还要注意培养基不同区域的划分和标记，以免相混。蛋白胨水培养基，所用蛋白胨最好用含色氨酸高的，这样现象会比较明显。 淀粉酶是胞外酶，因为微生物对大分子营养物质无法吸收到胞内进行利用，如果是胞内酶，则首先应该先将淀粉吸收到胞内，而微生物却不具有那种能力，因此必须先释放出胞外淀粉酶将淀粉水解为微生物可以吸收的大小，才能使微生物成长。如果不使用碘液，则可以延长培养的时间来进行观察，时间长了以后，菌落依然扩展的应该就为能释放淀粉胞外酶的菌种了。如果某些微生物为有氧代谢葡萄糖，则进行试验时，依然可以观察到气泡，但却应该观察不到颜色的变化了，因为颜色的改变源于酸性的增强。IVMiC试验主要功能为检查饮用水中的大肠杆菌和产气肠杆菌的有无及数量的多少，对饮用水达标很有作用。同时，在治疗时，可以使用这个试验对病人的肠道提取物进行试验，以此来分析肠道微生物成分进而分析病因。色氨酸分解后产生的吲哚，与对二甲基氨基苯甲酸反应后能产生显红色的玫瑰吲哚，易