生化大实验实验报告2

1、生 化 大 实 验实 验 报 告姓 名： 王国宾学 号：82101132325 班 级：硕士九班实验班级：一班 专 业：农药专业 实验一：多酚氧化酶(PPO)的分离提取一、实验目的通过本项实验，学习和了解蛋白质的提取、分离的基本原理和方法，掌握相关的仪器设备的正确使用的方法，以及蛋白质的提取分离的系统技术。二、实验原理：1.蛋白质在不同浓度的盐溶液中的的溶解度不同，通过向溶液中加入适量的固体硫酸铵来调节粗提液的盐浓度从而将PPO蛋白从体系中析出。2.大分子蛋白质不能通过透析膜。三、材料与试剂1.材料：马铃薯(约每小组100-200g)2.试剂：0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基

2、乙醇，0.001MEDTA，5甘油，1的聚乙烯吡咯烷酮)配制时配×10倍的浓缩液1000ml；固体硫酸铵；0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCl2)配置时配。3.实验器械与仪器设备：试管与试管架；烧杯、玻璃搅棒；移液管、滴管等；试剂瓶；透析袋；过滤纱布；植物组织匀浆器；pH计和pH试纸；GL20C高速冷冻离心机；DL一7A大容量低速冷冻离心机。四、操作步骤1.粗酶提取：马铃薯组织按1：1(WV)比例与0.03M磷酸缓冲液pH6.0(内含0.02M巯基乙醇，0.001MEDTA，5甘油，1聚乙烯吡咯烷酮)混合，匀浆后4层纱布过滤

3、，滤液以6000rpm离心10min，弃除沉淀获得酶提取液。2.盐析分级沉淀：在酶提取液中加入固体硫酸铵36.45g使其达到40%饱和度,边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min弃除沉淀，离心上清液再加入固体硫酸铵30.75g达到70%饱和度，边加边搅拌使硫酸铵充分溶解，然后6000rpm离心20min，弃除上清液，收集粗酶沉淀，沉淀用0.03M磷酸缓冲液（内含0.02M巯基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCl2,其液体pH6.0）溶解，装入透析袋中用0.02M KCl溶液透析至无硫酸根离子，获得粗酶液供上柱使用。五、实验结果和分析1.初提的酶液为米黄色，经

4、过夜透析后，得到了澄清的略带黄色的液体，可以用来进一步的柱层析。实验二：胰蛋白酶原的提取与分离一、实验目的 本实验拟通过从猪胰脏中制备胰酶结晶实验，掌握酶的制备、一般分离、提取、纯化和结晶的操作技术。同时为亲和层析、免疫学实验准备样品。二、实验原理胰酶是医药、食品、饲料等工业上重要的酶抑制剂，胰酶的分离提取是普通生化实验的最主要、最经典的实验。提取制备胰酶的经典方法，多采用硫酸铵分级沉淀，胰酶在75%饱和度硫酸铵中沉淀，其他杂蛋白一般在10%硫酸铵饱和度下被沉淀而除去。经此多次提取，最后在pH8.0硼酸缓冲液中得到结晶。胰酶在pH3.0时最稳定，可在低温下储存较长时间而不失活。低于此pH，酶易

5、变性；高于pH5.0时，酶易自容而失活。因此提取制备胰酶的全部操作过程宜在低pH和低温下进行。胰酶以无活性的酶原形式存在于动物的胰脏中。胰蛋白酶原在正常生理条件下可被肠激酶和钙离子所激活或自我活化成为有活性的酶。三、实验材料与试剂1.材料：新鲜猪胰脏2.试剂：pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M NaOH溶液、0.1M HCl溶液、0.025M HCl溶液、0.01M HCl溶液、0.4MpH9.0硼酸缓冲液（母液为0.8M，用时稀释一倍）、Tris、硫酸铵。四、操作步骤1.胰蛋白酶原的提取与分离（1）称取1-1.5Kg新鲜猪胰脏，在冰浴下剥除脂肪和结缔组织，在低温下用绞肉机绞

6、碎胰脏后，加入2倍体积已预冷的乙酸酸化水提取。在提取过程中，是提取液维持在pH2.5-3.0之间。在冷室5左右搅拌提取18-24h，而后用4层纱布过滤，尽量拧挤出滤液。用50ml乙酸酸化水再提取残渣一次，时间约为1-2h，合并滤液，将滤液pH值调至2.5-3.0，放置3-5h后，收集滤液，量其总体积。（2）盐析：加固体粉状硫酸铵进行盐析，使溶液至75%饱和度。盐析溶液放冷室中过夜，次日4000rpm离心，或用布式漏斗抽滤，滤饼经压干后称重，得到胰蛋白酶原粗制品。2.胰蛋白酶原的激活将胰蛋白酶原组分用10倍体积的冷蒸馏水，分多次加入使滤饼溶解，量其体积。取出1ml溶液用于测定溶液中硫酸铵的含量。

7、因为硫酸铵可与活化剂钙离子结合，生成硫酸钙，如果钙离子过少会直接影响胰酶原的激活过程。因此按上述滤饼中含有的硫酸铵与钙结合生成CaSO4之后，尚保存0.1McaCl2慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀。用5M NaOH溶液调节pH至8.0。3.纯化去除杂蛋白，量取胰蛋白酶溶液体积后，用5M硫酸溶液调节滤液pH至2.5-3.0，抽滤除去硫酸钙沉淀，得滤液。加入已研细的硫酸铵粉末，使其溶液达40%饱和度。放置5冰箱中5-8h，抽滤除去沉淀，保留滤液。再向该滤液中加入固体硫酸铵粉末使其溶液达75%饱和度，放5冰箱过夜，次日抽滤收集沉淀压干后称重。五、实验结果与讨论1. 得到澄清的酶液。2. 用新鲜的

8、猪胰脏是因为新鲜的胰脏胰酶含量高，容易分离提取。3. 提取过程中保持pH值2.5-3.0之间，是因为胰酶在低pH值下没有活性，不会催化其他蛋白的水解从而降低酶的含量。实验三：卵清蛋白分离提取一、实验目的 掌握鸡卵清蛋白的提取方法和操作步骤。二、实验原理鸡卵粘蛋白存在于鸡蛋清中，对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，高纯度的鸡卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比为1:1。鸡卵粘蛋白是糖蛋白，分子量为28000，但糖成份上有差别。有四种不同组份，等电点的范围为pH 3.94.5,280 nm的消光系数为：A4.13（1,1 cm）。鸡卵粘蛋白在中性或酸性溶液中对热和高浓度的脲都是相当稳定的，而在碱性溶液中比较不稳定

9、。由于鸡卵粘蛋白对胰蛋白酶有强烈的抑制作用，因此可以用鸡卵粘蛋白作亲和配基制备纯化胰酶的亲和柱材。三、实验材料与试剂1.材料：新鲜鸡蛋2只2.试剂：10 TCA（用固体NaOH调pH至1.051.10，需要50 ml）；5 N HCL；5 N NaOH；冷丙酮；胰蛋白酶液；BAEE0.05 M；pH 8.0 TrisHCL缓冲液（每ml含0.34BAEE和2.22 mg CaCl2，50 ml。）；pH 8.0，0.1 M TrisHCL缓冲液。四、操作步骤1.取两只新鲜鸡蛋，得蛋清50 ml，置于烧杯中，外用温水浴2530，在不断搅拌条件下，缓慢加入等体积的三氯乙酸丙酮（1:2V/V），立即

10、出现大量白色絮状沉淀，加完后最终pH约3.5，再继续搅拌30 min，然后在4放置过夜。2.次日用布氏漏斗抽滤，得黄绿色清液。3.边搅拌边加入4预冷的丙酮200 ml沉淀蛋白，在4放置2 h之后将上清液小心倒入瓶中回收，下部沉淀部分于10000 rpm离心5 min，收集沉淀。4.将沉淀溶于10 ml无离子水中，对无离子水（50倍）透析4 h，换水两次，再对碳酸钠缓冲溶液透析过夜，4000 rpm离心10 min，去除不溶物，取少量上清液，用水稀释适当倍数，测A280计算所得蛋白总量。五、实验结果与分析1. 上清液中得到含有分离提取的卵蛋白，所得卵清蛋白用于胰酶的柱层析。2.在实验中要控制pH

11、值，不能使其成碱性，否则粘蛋白会分解，影响粘蛋白的量。3.在离心以后一定要弄清楚是收集沉淀还是上清液，否则实验将会失败。实验四：凝胶色谱层析纯化PPO一、实验目的 通过凝胶色谱层析分离纯化PPO的操作，以期掌握凝胶色谱层析的基本原理、运用及操作技术，并了解凝胶色谱测定蛋白质分子量的基本原理和操作方法。二、实验原理柱层析技术是常用的纯化酶、蛋白质的手段。在普通生化操作中经常通过离子交换层析和凝胶层析联用实现蛋白质的纯化。选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下米，达到分离纯化的目的。凝胶色谱技术使入十年代初发展起来的一种快速、简单的分离技术，设备简单、操作方便，对蛋白质等高分子物质有很高

12、的分离效果。 其分离纯化蛋向质的原理使分子筛效应：即凝胶色谱柱的重要参数，由于凝胶色谱分离蛋白质是根据分子量大小进行的，蛋白质的洗脱体积与分子量对数大小负相关，因此利用标准分子量及其洗脱体积可作分子量洗脱体积的标准曲线，根据曲线和未知蛋白的洗脱体积可以求得待分离蛋白的分子量人小。三、材料与试剂1.试剂：0.02M TrisHCL缓冲液Ph7.4(内含0.00lM EDTA)配制时配×10倍浓缩1000m1；NaCl；聚已二醇；DEAE纤维素DE52；葡聚糖凝胶Sephadex G200：兰葡萄糖一40、70、100等；2.实验器械与仪器设备：试管与试管架、烧杯、玻璃搅棒、移液管、滴管

13、等；试剂瓶、层析柱、pH计和pH试纸、恒流泵、梯度混合仪、核酸蛋白监测仪、GL-20C高速冷冻离心机、DL-7A大容量低速冷冻离心机四、操作步骤1.葡聚糖凝胶的处理、装柱及平衡（1）柱材处理称取一定量的Sephadex G200干粉，加无离子水或蒸馏水浸泡溶胀48 h，去掉悬浮的细微颗粒，为防止凝胶颗粒中的空气存在，影响层析效果，凝胶装柱前一定要将凝胶液中的气体除掉，其办法是将凝胶液放进抽滤瓶中，进行抽真空处理，直到凝胶液中没有气泡出现为止。（2）装柱将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的凝胶液（凝胶的浓度过高会产生气泡

14、，影响蛋白质分离速度，浓度过低易产生凝胶分层，影响蛋白质的分离效果）轻轻倒入层析柱中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.52 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。（3）平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程中的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.51 ml/ min，当下出口流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中用0

15、.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE52柱进行平衡。2.上样将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白。3.洗脱用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱，收集洗脱液进行酶活性、蛋白质浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳分子量的基本性质分析测定。实验五：离子交换层析进一步纯化PPO一、原理离子交换剂是一种不溶性高分子化合物，分子中含有可解离的基团，在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。当一定量的溶液通过交换柱是时，溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，

16、全部被交换并吸附在树脂上。交换反应都是平衡反应，在连续添加新的交换溶液下，平衡不断按正方向进行，直至完全把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。两种以上的成分被交换吸附在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，被洗脱的能力则决定于各自洗脱反应的平衡常数。蛋白质的洗脱过程分两个阶段吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质通过改变PH使吸附的蛋白质火去电荷而达到解离。通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数日不同，亲和力大小有差异。二、实验试剂0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）

17、配制时配×10倍浓缩液1000ml；NaCl；聚乙二醇；DEAE纤维素 DE52。三、操作步骤1. DEAE纤维素的处理及装柱（1）处理 AE纤维素 DE 52弱碱型阴离子交换剂，具体处理方法为：先将DE 52阴离子交换剂干粉浸泡于蒸馏水中，去除杂质；再在0.5N的Hcl溶液中浸泡12h，用无离子水或蒸馏水洗至pH值中性或pH4以上，并将其在抽滤斗中抽干；将抽干的离子交换剂浸泡在0.5N的HCl溶液中浸泡12h，再用无离子水或蒸馏水洗至中性。（2）装柱 将层析柱清洗干净垂直固定到层析架上，加1/3体积的无离子水，打开下出液口，水流畅通，即刻将小烧杯中装有适宜浓度的柱材，轻轻倒入层析柱

18、中，凝胶自然慢慢沉降在层析柱底部，凝胶沉积直到离层析柱上端1.52 cm处，停止装柱。层析柱上端进液口连接恒流泵，下出液口连接蛋白检测议，待层析柱的平衡。（3）平衡 在柱层析上样前必须对层析柱进行平衡，所谓平衡就是将层析柱中的溶液用层析过程中的缓冲液（洗脱液）置换出来，使层析柱中的缓冲系统与柱层析过程中的系统一致。其方法是：利用层析柱上端的恒流泵将平衡缓冲液泵入到层析柱内，打开层析柱下端的出口，平衡液流速在0.51 ml/ min，当下出口流出液的pH值与平衡缓冲液的pH值一致时，层析柱达到了平衡。在本实验中用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）预先将DE

19、52柱进行平衡。2.上样：将粗酶液上柱，用0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）洗脱杂蛋白。3.洗脱：用含有0.2-0.6MnaCl的0.02M Tris-HCl缓冲液pH7.4（内含0.001M EDTA）进行梯度洗脱。4.收集PPO活性部分洗脱液，测定酶活性和蛋白浓度。实验六：PPO酶含量和活性的测定一、蛋白质含量测定一考马斯亮蓝G250法测定蛋白质浓度（一）实验原理与目的考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度的基本原理是：考马斯亮蓝G-250本身为红色，当与蛋白质结合时，红色就转变为蓝色，使染料的最大吸收峰从465nm转移到590nm，染料与蛋白质的结合

20、与595nm的吸收值在一定蛋白质浓度下呈线形相关，其蛋白结合反应在23min内完成，而反应生成的复合物在1h内比较稳定地存在于溶液中，因此,用标准浓度地蛋白测得OD595值绘制标准曲线，即可求得待测样品中蛋白质浓度。此方法试剂简单、经济。测定简便快捷，具有与Lawry法相当的灵敏度，受溶液中其它物质的干扰很小，并且可采用对照来消除。（二）仪器与试剂1.材料：经硫酸铵沉淀获得PPO粗酶液，DEAE一纤维素DE52分离的酶液和Sephadex G一200分离纯化的酶液样品。 2.仪器与器皿：分光光度计，分析天平，容量瓶，移液管和试管等。3.试剂：考马斯亮蓝G一250蛋白试剂：称取100mg考马斯亮

21、蓝G一250溶于50ml 90的乙醇中，加入85(VV)磷酸100ml，最后加入无离子水或蒸馏水定容到1000ml。 （三）作步骤样品中蛋白质浓度的测定：考马斯亮蓝G250 l00l，样品20l，对照用TrisHCl 20l。再用制作标准曲线的方法对样品进行测定，测定的0D595值结果由标准曲线求出样品的蛋白质浓度。二、 PPO活性测定（一）原理与方法 PPO催化各种酚与O2氧化为醌。本实验是采用邻苯二酚为底物，在0.2M磷酸氢二钠-0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8的反应体系中，PPO催化邻苯二酚形成褐色的醌，在分光光度计410nm处使反应体系的OD值产生变化，通过OD值上升的读数变化确定PPO

22、的酶活大小。其方法是：在含有4mlPH5.8的O.2M磷酸氢二钠0.1M柠檬酸缓冲液试管中加入0.05m10.05M邻苯二酚溶液，在30恒温水浴中预热后加入0.05ml酶液，反应5分钟，在分光光度计410nm处读取吸光值。在上述条件下，以A410读数，以每分钟增加0.01OD值定义为一个酶活性单位(U)。（二）仪器与试剂(1)样品：凝胶色谱DE52层析纯化洗脱组分；葡聚糖凝胶洗脱组分(2)底物：邻苯二酚；0.01M邻苯二酚溶液(3)反应体系：O.2M邻酸二氢钠0.1M柠檬酸缓冲液PH5.8(4)器皿与仪器：试管、恒温水浴等，分光光度计（三）实验步骤样品中蛋白质活性的测定：柠檬酸缓冲液（buff

23、er）20l，底物邻苯二酚20ul样品20l，对照用TrisHCl 20l。在分光光度计410nm下测定酶活。（四）实验结果：凝胶色谱层析纯化后PPO酶蛋白质含量和活性的测定样品活性活性CK（1）0.000.00粗酶（2）0.5050.08130.5310.07540.3611.74050.2960.52760.2280.16370.1780.07080.1560.14090.140.077100.0400.079110.0690.047实验七：亲和层析纯化胰酶一、试验目的与原理目的：通过将胰蛋白酶和抑制剂-鸡卵粘蛋白与sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，来了解亲和层析的基本

24、原理，掌握亲和柱层析和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。原理：利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。本实验通过将胰蛋白酶抑制剂鸡卵粘蛋白与Sephadex-G75偶联及亲和层析纯化胰酶的操作，以了解亲和层析的基本原理，掌握亲和柱材活化偶联及亲和层析操作的基本过程和技术。二、仪器与试剂1.材料：粗胰蛋白酶、鸡卵粘蛋白、SepharoseG752.试剂：0.05M NaIO4溶液、5% K2CO3、0.27gKBH4、0.1M Tris-HCl pH7.5(含0.5M KCl，0.05M CaCl2)、0.1N 甲酸钾-0.5M KCl pH2

25、.5三、实验步骤1. SepharoseG75的活化及偶联将2.5g干重的葡聚糖凝胶SepharoseG75溶胀洗涤数次、缓慢搅拌，加入0.05M NaIO4溶液50ml，静置30min后，蒸馏水洗涤数次，抽干备用。接着，将纯化的鸡卵粘蛋白溶于水中，加入已经活化好的葡聚糖凝胶。用5% K2CO3调节溶液pH至7.5-9.0，缓慢搅拌3h。在此过程中一定要保持pH的稳定。将0.27gKBH4溶于20ml水中，缓慢搅拌加入上述体系反应5h，pH维持在6.5-7.5之间，洗涤数次备用。2.亲和层析将鸡卵粘蛋白SepharoseG75 装柱（1×10 cm）,用pH7.5, 0.1 M含0.

26、5 M KCl，0.05 M CaCl2的缓冲液平衡，平衡约23倍的柱体积。将粗胰酶液上样柱层析。用紫外蛋白监测仪280 nm处监测蛋白吸收峰，随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH 7.5的平衡缓冲液洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1 N的甲酸钾0.5 M KCl，pH 2.5的洗脱液解吸，柱的流速维持在1.5 ml /min左右，收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，则总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。

27、当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱可以反复使用。四、实验结果与分析本实验中序号2-9为收集液，经测定吸光值第6瓶最高用于后续的电泳。样品空白透析液混合液23456789蛋白00.5470.3430.0140.0250.0180.0210.0240.0170.0340.031酶活00.640.430.120.080.070.060.100.060.120.10五、注意事项1.在上样品时可以多上一些，若柱子装不下，可以将下端出液口打开，放出部分液体，待到检测仪的读数有大的变化时收集洗液。2.层析柱一定要平衡好后才能使用，否则实验结果会很不准确。3.检测仪使用前一定

28、要调零，还要使用正确的档位。实验八：SDSPAGE测定蛋白质分子量及蛋白质的纯度鉴定一、实验目的与原理目的：本实验的是对多酚氧化酶的纯化度鉴定及分子量的测定，通过实验，学习和掌握SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质纯度和分子量的鉴定。原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决丁它所带电荷以及分子大小和形状等因素。每克蛋白质结合1.4g的SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋向质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋向质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间是负相关。二、仪器与试剂1.材

29、料：硫酸铵盐析沉淀的多酚氧化酶粗酶样品、DEAE-纤维素DE52柱层忻的品和SephadexG-100柱层析的样品。2.试剂：(1)丙烯酰胺(Acr母液)：30Acr (AcrBis)；(2)10的SDS溶液；(3)10的过硫酸铵溶液；(4)四甲基乙二胺(TEMED)；(5)分离胶缓冲液：1.5M Tris，PH8.8；(6)浓缩胶缓冲液：1.0M Tris，PH6.8；(7)电极缓冲液：10×30g Tris，125g甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml，pH8.3；(8)样品缓冲液：0.2M Tris，PH6.8，lSDS，30甘油，巯基乙醇及溴酚兰；(9)染色液：0

30、.15考马斯亮蓝R250，溶于脱色液；(10)脱色液：50的甲醇，7的冰醋酸的水溶液；(11)标准分子量蛋白。3.仪器设备：电泳仪，垂直电泳槽等。三、实验步骤1.凝胶制备：用两块电泳玻璃板制成垂直板槽（注意不能漏胶），垂直放置。将下表列出的的配方，配成分离胶溶液，立即倒入垂直槽，并慢慢加入无离子水，将凝胶液面压平，20 min后凝聚。倒出无离子水，用吸水纸吸干，倒人按表配成的浓缩胶，再插入梳子。SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制（10）分离胶试剂体积（ml）Acr储液10分离胶缓冲液1010%SDS10%APS0.60.1TEMED0.02补水至30浓缩胶（3.5%）试 剂体 积（ml）Acr 储液2

31、.2缓冲液3.010%SDS10%APS0.30.1TEMED0.02补水至202.点样： 分别取样品若干毫升于离心管中，按1：11：5的比例加入5×样品缓冲液，在沸水浴中加热35 min，取出待用。用微量注射器分别吸取不超过30l不同浓度的标准蛋白样品和实验样品注入样品槽。点样结束后，调节电泳仪电流升到10 mA，当溴酚蓝进入分离胶将电源加到1520 mA（23 mA/em）,保持电流稳定不变，当溴酚蓝迁移到离分离胶底12 cm时，即可停止电泳。3.染色：电泳完毕后，取出凝胶板，浸入染色液中，在37温箱中保温过夜。倒掉染色液，用脱色液，用脱色液脱掉剩余染料后，倒入脱色液第二天换一次

32、脱色液，24 h后，即可看到清晰的蛋白质条带。四、实验结果及注意事项1、实验结果：2、影响蛋白质电泳分离效果的因素：（1）蛋白质样品中的盐浓度 影响蛋白条带的迁移率和带型，因此为消除盐浓度的影响，溶解蛋白时最好用去离子水，再加等量2×SDS-PAGE样品缓冲液，必要时经过透析或进行Sephader G25过柱。（2）SDS的质量 由于变性蛋白是与SDS结合而带负电荷，蛋白结合SDS的量与蛋白质的分子量成正比，因此质量不同的SDS，相同的蛋白质样品，将可能出现不同迁移率的电泳图谱。（3）上样孔是否平齐，若上样孔不平齐，也影响蛋白电泳的迁移率。（4）为防止相邻泳道样品的扩散，而导致电泳条

33、带的不整齐，如有空置的加样孔，须加等体积的空白1×SDS样品缓冲液。实验九：Western-blotting一、实验原理Western印迹法检测蛋白敏感度达1-5ng，0.75mm厚的SDS-PAGE板一个孔能检测出来的蛋白量为100g，只要不低于总蛋白量万分之一，就能被检测。分析样品未知时，应同时有阳性对照。杂交技术主要有NC膜的封闭，靶蛋白与一抗反应，结合的靶蛋白的一抗与二抗反应，显色。技术的主要原理为转移到NC膜上的蛋白带，用其他蛋白为封闭液，封闭其他蛋白的可结合位点，加入特异性的一抗，免疫反应，一抗与靶蛋白结合，加入二抗，使之与一抗反应，反应后，洗涤除去多余二抗。二抗为酶标抗

34、体，通过酶标反应，在显色液中可呈现结合结合一抗、二抗的靶蛋白。二、仪器与试剂1.材料：检测蛋白2.仪器：电转移槽，电泳仪，塑料封口机，摇床3.试剂：点击缓冲液加20%甲醇，封闭液（1%脱脂奶粉溶于TBST中），TBST（150mM NaCl，50mM Tris-HCl ，pH 7.5）0.01% antiform，0.02% 叠氮钠，二抗稀释液，0.5% Tween20，碱性磷酸盐显色液三、操作步骤1、剪6块3mm滤纸，和一块Nc膜。将剪好的3mm滤纸和Nc膜在转移缓冲液中浸泡5分钟。2、安装转移装置，将3块3mm的滤纸放在海绵上，然后依次将NC膜，凝胶即为蛋白质电泳所得的粗胰酶，提纯以后的胰

35、酶条带以及标准酶条带），另3块滤纸海绵的顺序放好。在支架加紧上述几层，放入电泳槽中，NC膜的一次向正极，凝胶一侧向负极。3、在40V电压下电泳6小时。转移结束后，切下一个孔所对应的膜的一半用考马斯亮兰染色。观察转移效果。将其余的NC膜放在一张干净的3mm滤纸上，室温干燥1小时。将NC膜封闭：将干燥后的Nc膜放于平皿中，加入封闭液，液面要没住，轻轻摇荡2小时。将第一抗体用封闭液稀释，将封闭好的NC膜放入塑料袋中，加入一抗0.1ml，将袋中气泡排除，封口，4下轻轻振荡2小时。4、反应结束，剪开塑料袋，弃去反应液，用PBS洗三次，将膜放入一个塑料袋中，加入稀释过的二抗溶液0.1ml，封口，在室温下振

36、荡1小时。反映结束，取出，用PBS洗3次。将膜放入显色液中，室温下轻轻摇荡。待条带出现后，用水冲洗，刚TE终止。四、实验结果经过一系列的实验过程，最终NC膜上出现与凝胶上相一致的较为模糊的浅色蓝色条带，实验基本完成。四、注意事项安装放置顺序为：滤纸、NC膜、胶、滤纸。并且膜要靠近正极，因为蛋白质变形后带负电，从负极转移到正极。实验十：染色体DNA的提取一、实验目的与原理DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象。本实验通过裂解液裂解细胞，有机溶剂反复抽提，使DNA进入水相与蛋白成分分开，在RNase作用下，降解RNA以纯化DNA。通过实验学习和掌握提取植物染色体

37、DNA的原理和方法。二、材料与试剂1.材料：大肠杆菌2.试剂: 细胞裂解液 100mM Tris-HCl、 5mM EDTA、500mM NaCl、1.25% SDS、pH 7.5； 饱和酚；氯仿/异戊醇；酚/氯仿/异戊醇；70%及无水乙醇；3M NaAC ；50×TAE缓冲液；电泳载样缓冲液；无菌水三、操作步骤:1.将培养好的菌液1.5ml，离心除去上清液收集菌体，10000rpm,1-3min。2.加入65预热的细胞裂解液600l悬浮菌体，再加入60l饱和苯酚滚动混匀后，65水浴30 min。3.加入600l氯仿混匀，静置4-5 min后10000rpm离心15 min，取上清液

38、。4.等体积氯仿再抽提一次，静置2min后10000rpm离心15 min，取上清液。5.加入2倍体积冷无水乙醇（-20）、0.1体积3M乙酸钠（pH5.2），置于室温10 min,12000-15000rpm离心10 min。6.70%乙醇洗涤DNA一次,无水乙醇沉淀DNA，12000-15000rpm离心10min。7.将沉淀的DNA溶于40-100l的无菌水中。8.1%琼脂糖凝胶电泳检测提取质量。四、实验结果五、注意事项实验结果较为理想可能是在DNA提取过程中注意到了以下几个问题：1.加入裂解液后使菌体与裂解液充分接触，充分裂解。2.饱和苯酚使得与DNA结合在一起的蛋白质充分变性，彻底除

39、去蛋白质。3.取上清液时应该遵守宁可少得上清，也不要将下层取出的原则。4.提取DNA时动作要轻，不能搅拌，应滚动混匀或是颠倒混实验十一：质粒DNA的提取与纯化一、实验原理与目的 目的：掌握碱变性抽提质粒法的一般步骤和操作方法，熟悉质粒的纯化方法和步骤。原理：细菌质粒多为一些双链、环状的DNA分子，其大小范围从1Kb-200以上Kb不等，它们是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒的存在能赋于菌体一些特殊的表型，这些表型主要有对抗生素的抗性、修饰酶等。由于有些质粒与DNA分子量较小特别是与自身遗传有关的DNA分子极小，可携带外源基因量较大，且转移性强、拷贝数高(松弛型质粒)、还

40、带有选择性标记，因此质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时的最主要的DNA载体。质粒DNA的提取可以说是分子生物学实验中的最基本、最重要的实验。质粒DNA的提取根据实验目的不同，可以有不同的方法，但基本步骤多为三步，第一细菌培养和质粒的扩增，第二细菌菌体的裂解，第三质粒DNA的纯化。二、材料与试剂1.材料：大肠杆菌2.试剂 Solution 50mM 葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0), 高压灭菌，4保存 Solution 0.2M NaOH, 1% SDS, 现配现用 Solution 5N KAC pH 4.8, 高

41、压灭菌，4保存 3M NaAC pH 5.2 高压灭菌，4保存, 5：氨苄青霉素 25mg/ml, 溶菌酶 8mg/ml, 氯仿/酚, 异丙醇, LB培养基, 电泳试剂三、操作步骤:1. 2ml/20ml 培养菌体 37 200rpm 过夜，4 5000rpm离心10min沉淀菌体细胞。2. 预冷的TES 缓冲液洗涤沉淀，4 5000rpm离心10min沉淀菌体细胞。3. 加入预冷的1ml Solution ,冰浴,10min。4. 重新悬浮，加入150l溶菌酶母液，室温放置5min。5. 加入1.2mlSolution ,冰浴中5min后,加入0.9ml预冷乙酸钾混匀, 4、12000rpm

42、离心10min，取上清。6. 1.5ml异丙醇,-20冰箱内放置15min, 4、12000rpm离心10min，取沉淀。7. 悬于400lTE缓冲液中,加入40l,3M NaAC,酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀, 4、12000rpm离心10min，取沉淀。8. 冷冻干燥后再悬浮于50lTE缓冲液中。9. 电泳检测提取质量。五、实验结果分析1.该实验成功的标志是把染色体DNA、蛋白质与RNA去除干净，获得一定得率的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难，因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液与溶液时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用

43、使之变性，又要使染色体DNA不断裂解成小片段，从而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀，摇动时用力适当，一般来说当溶液加入时可用力振荡几次，因为此时细菌还没有与碱和SDS作用，染色体DNA尚未释放，不必担心其分子断裂，加入SDS后，则要注意不能过分用力振荡，温和混匀,但又必须让它反应充分。加入溶液II混匀之后,一定在冰上放置,不要摇动,对于溶液III,同样处理。2. 加入溶液I之前,注意将离心管倒扣过来,将培养基完全流出.3加乙醇沉淀DNA时，要把离心管加盖倒翻摇动45次，注意观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可以放在冰箱中去沉淀DNA,以获得更多的DNA。4乙醇沉淀DNA离

44、心后，要把离心管四周的上清液抽干或自然挥发(可将离心管倒置于滤纸上以尽量让管内液体流出)。否则，用TE缓冲液溶解DNA时，既困难又不完全。5为了得到纯净的DNA样品和清晰的电泳条带，加入1l RNA酶，将管置50水浴箱内30min，消化RNA。6抽提产物经电泳分离、EB染色后，在紫外线灯下可观察到三个条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒DNA。实验十二：DNA片断的酶切技术一、实验目的与原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,这类酶的发现和应用促进了以DNA重组为基础的生物工程技术的迅猛发展。该类酶是体外剪切基因片段的重要工具。本部分实验主要通过Eco

45、R，Hind 两种限制性内切酶对DNA的双酶切及部分酶切操作，使学员能掌握内切酶的实验操作技术。二、材料与试剂1.材料：DNA2.试剂 EcoR及缓冲液 Hind 及缓冲液 DNA 0.532g/l TAE缓冲液三、操作步骤EcoR 、Hind 双酶切取3支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入(体系均为20l)：模板基因组DNA 4l质粒DNA 4l-DNA 2l缓冲液2l2l2lEcoR1l1l1lHind 1l1l1lddH2O12l12l14l37保温1-2小时，保温结束后，加入0.5M(pH 7.2)EDTA(使终浓度达到10mM)，加入6l电泳加样缓冲液，电泳分析。四、实验

46、结果五、实验结果分析1.建立一个标准的酶切反应 目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1g不同来源和纯度的DNA。通常，一个50l的反应体系中，1l的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1g已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。2.选择正确的酶 不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。内切酶的产物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端产物

47、可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。3. 酶 内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。4.DNA 待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。5.缓冲液 对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100g/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/

48、ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。6.反应体积 内切酶活力单位的定义是：1小时内，50l反应体积中，降解1g的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。7.混合 这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。8.反应温度 大部分酶的反应温度为37°C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。

49、一般为50-65°C不等。9.反应时间 1酶活单位的定义时间为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。10.对照反应 如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确

50、定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。实验十三：DNA片断的连接技术一、实验目的与原理 DNA酶切片段的连接是两DNA片段相邻的5'磷酸和3'羟基间可由连接酶催化形成磷酸二酯键，这个连接反应在体外一般都有大肠杆菌DNA连接酶和T4DNA连接酶催化，但分子生物学实验中主要采用T4DNA连接酶，因该酶在正常条件下，即能完成连接反应。本实验拟通过T4DNA连接酶对酶切片段的连接操作，使学员掌握这一DNA片段的连接技术。二、试剂T4DNA连接酶；10×T4DNA连接酶缓冲液；200mM Tris-HCL (pH

51、7.6)；50mM MgCl2；50mM DTT；500g/ml 牛血清白蛋白；5mM ATP ；DNA；酚/氯仿；酚 ；TE缓冲液；电泳缓冲液；3M NaAC。三、操作步骤取1支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入(体系为10l)：10×连接酶缓冲液1载体1-DNA3连接酶1ddH2O416过夜。提取已联接好的DNA片段，电泳分析。四、实验注意事项1. 10x Ligation Buffer含有ATP，使用前应在室温放置至融化或用手掌温度辅助融化，然后置于冰上。不要加热融化以免ATP降解。2.T4 DNA Ligase对热敏感，容易失活。使用时请放置冰上，用后立即置冰箱中

52、冷冻保存。3.插入片断和载体片断的比例要高。4.反应体系10l，不要太大。实验十四：受体菌感受态细胞的制备一、实验目的与原理目的：本实验拟通过这方面的操作，让学员了解和学习感受态细胞的制备过程。原理：当细菌处于容易吸收外源DNA的状态时，即为感受态，而用理化手段使细菌处于感受态的操作为致敏过程。感受态细胞制备是重组基因能否实现转化的一重要的技术关节。二、材料与试剂 1.材料：大肠杆菌 2.试剂 LB培养基、0.1N CaCl2、0.1M MgCl2、3mM 氯化6氨合高钴；TFB: 10mM MES (pH 6.3)；45mM MnCl2；10mM CaCl2；100mM KCl三、操作步骤1

53、.大肠杆菌在LB平板上划线培养12-16小时，挑取单菌落于LB培养基中摇瓶培养大肠杆菌到对数期。2.取1ml培养物7000rpm,离心3min.收集菌体，冰浴放置。3.用预冷的氯化镁悬浮菌体，7000rpm离心3min.收集菌体，冰浴放置。4.用预冷的氯化钙悬浮菌体，冰浴15min，7000rpm离心3min收集菌体，冰浴放置。5.加入200l预冷氯化钙(或TFB)，放置于冰浴，即得感受态细胞。四、实验结果与分析获得了良好的大肠杆菌感受态细胞。感受态细胞制备及转化中的影响因素：1. 细胞的生长状态和密度最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，

54、及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为05时，细胞密度在5×107个/ml左右。（应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。2. 质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外