层析技术的应用

1、层析技术的应用一、层析技术的原理和分类（一）层析技术的原理层析法是目前广泛应用的一种分离技术。本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。现在层析法已成为生物化学、分子生物学及其它学科领域有 效的分离分析工具之一。层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。所有的层析系统都由两个相组成：一是固 定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，如水和各 种溶媒。当待分离的混合物随溶媒（流动相）通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发 生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中

2、的分配（含量对比）不同，而且随溶媒向前移 动，各组份不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作 用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流岀液， 可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。（二）层析法分类见表16-57（三）层析法的特点与应用表16-5按两相所处状态分类流动相液体气体液体液-液层析法气-液层析法固定相固体液-固层析法气-固层析法层析法是根据物质的理化性质不同而建立的分离分析方法。根据层析峰的位置及峰高或峰面积，可以 定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测岀层析后各

3、组份的浓度或质量，同时绘岀层 析图。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。由于层析法具有分辨 率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生 物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高 分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。表16-6按层析原理分类名称分离原理吸附层析法组份在吸附剂表面吸附固定相是固体吸附剂，各能力不同分配层析法各组份在流动相和静止液相（固相）中的分配系数不同离子交换层析法固定相是离子交换剂，各组份与离子交换剂亲和力不同凝胶层析法固定相是多孔凝胶，

4、各组份的分子大小不同，因而在 凝胶上受阻滞的程度不同亲和层析法固定相只能与一种待分离组份专一结合，以此和无亲和力的其它组份分离表16-7按操作形式不同分类名称操作形式柱层析法固定相装于柱内，使样品沿着一个方向前移而达分离薄层层析法将适当粘度的固定相均匀涂铺在薄板上，点样后用流动相展开，使各组份分离纸层析法用滤纸作液体的载体，点样后用流动相展开，使各组份分离薄膜层析法将适当的高分子有机吸附剂制成薄膜，以类似纸层析方法进行物质的分离二、层析法实验技术（一）凝胶层析法凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析等。它的突岀优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷， 吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度

5、范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性 质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。1.凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用 和G-50，对于小肽和低分子量的物质(1000-5000)的脱盐可使用Sephadex G-10,G-15及Bio-Gel-p-Sephadex G-252或4。如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。 一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到

6、凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。2.柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。3.凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻岀去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。凝胶的装填：将层析柱与地面垂直

7、固定在架子上，下端流岀口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌 装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下 使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在 凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加 到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带岀现歪曲、 散乱、变宽时必须重新装柱。4.加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下

8、数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%-10%。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过5-2。样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。5.凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02

9、%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。6.凝胶层析的应用脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的

10、25%-30%， 为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。1.测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析， 记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即 分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲

11、线的凝胶柱内洗肿后，根据 物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将 溶胀的凝胶分离岀去，就得到了浓缩的高分子溶液。（二）离子交换层析法离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相， 利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换 性质来分离离子型化合物的一种方法。1.离子交换剂预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较 好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交

12、换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或0H-的交换剂型。阴离子交换剂常用碱-酸-碱”处理，使最终转为-0H-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用酸-碱-酸”处理，使最终转为-H-型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗， 直至达到充分平衡方可使用。2.加样与洗脱加样： 层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度

13、应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的 方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与 离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方 法是连续梯度

14、洗脱，洗脱装置见图16-6。两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流 入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的 洗脱能力即成梯度变化。第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算：C=C2-(C2-Ci)(1-V)A2/A1式中Ai、A2分别代表两容器的截面积：Ci、C2分别表示容器中溶液的浓度；V为流出体积对总体积之比。当Ai=A2时为线性梯度，当AiA2时为凹形梯度，AiA2时为凸形梯度。洗脱时应满足以下要求：洗脱液体积应足够大，一般

15、要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰 形过宽。1%-5%。图16-6梯度洗脱示意图3.洗脱馏份的分析 按一定体积（5-10ml/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验 目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。4.离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/:NaCI淋洗柱，若 有强吸附物则可用0.1mol/l

16、 NaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/l NaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交 换剂宜用0.002%氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（0.005%）。有些产品建立用0.02%叠氮钠。5.离子交换层析的应用离子交换层析技术已广泛用于各学科领域。在生物化学及临床生化检验中主要 用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其它带电荷的生物分子。（三）高效液相层析法高效液相层析法（HPLC）是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了

17、气相层析的理论具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极广，无论是极性还是非极性，小分子还是大分子，热稳定还是不稳定的化合物 均可用此法测定。对蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤为有利。高效液相层析法的基本概念和分离理论与经典的液相色谱法及气相色谱法一致，因而其塔板理论及动力学理论等都可用于高效液相层析。1.高效液相层析仪典型的高效液相层析仪包括输液系统、层析柱与检测系统三部分。流动相用一高压 泵输入。这种高压泵应满足以下条件：流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围。能抗溶剂腐蚀。有较高的输出压力，一般要达到15300kg/c，也有的高达

18、800kg/c。泵的死体积要小。 梯度洗脱装置必 须具备两台高压泵，一台输送强溶剂，一台输送弱溶剂，两泵运转速度用电脑控制，并可按一定的要求改 变流动相的组成，以改善分离效果。一般用微量注射器直接进样，也可采用六通阀门进样。HPLC中所用的检测器最多应用的是紫外吸收检测，灵敏度可达ng水平。此外，还有荧光检测器、示差析光检测器、电化学检测器等。2.HPLC的类型与应用液-固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺 凝胶等。液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短

19、，并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中 底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环 已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于 分离异构体、抗氧化剂与维生素等。液-液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液-液层析称为化学键合相层析。 另一种利用离子对原理的液-液分配层析为离子对层析。化学键合层析分：极性键合相层析：固定相为极 性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极

20、性较小的溶剂。极性小的组份先岀峰，极性大的 后岀峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。非极性键合相层析：固定相为非极性基团，如十 八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。 最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因 吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先岀峰，极性小的组份后岀峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。 本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。离子对分配层析分：正相离 子对层析：此法常以水吸附在硅胶上作为固定相，把与分离组份带相反电荷的配对离子以一定浓

21、度溶于水 或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中，待分离的离子与水相中配对离子 形成中性离子对，在水相和有机相中进行分配，而达到分离。本法优点是流动相选择余地大，缺点是固定 相易流失。反向离子对层析：固定相是疏水性键合硅胶，如C18键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最

22、好在被分离酸、碱的pK值附近。（四）亲和层析法亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层 析技术。性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混合组份的样品通 过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关 组份就随流动相流出，然后改变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质， 与基质共价连接的化合物称配基。亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离

23、含量极少又不稳定的活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定 的限制。亲和层析可用于纯化生物大分子：稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏；从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配体的生物大分子；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方 面。应用实例：2-胰凝乳蛋白酶的提纯1.亲和吸附剂（习氨基-N-乙酰-D-色氨酸）的制备取一定体积的Sepharose4B加lOOmgCNBr。搅拌混合物，滴加2-8mol/l NaOH，使溶液pH维持在11.0。20C左右，8-12分钟完成反应。在布氏漏斗中抽 滤活化的琼脂糖，然后用20倍体积冷的0.1mol/l NaHCO3（pH9.0）溶液洗涤。将上述活化的Sepharose4B与等体积0.1mol/l NaHCO3（pH9.0并在冰箱中预冷）溶液混合，接着迅速加入a胰蛋白酶抑制剂（工-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制剂的最大用量为每毫升Sepharose 4B 65呵ol/L。4 C缓慢搅拌约24小时，而后