链霉素残留酶联免疫检测试剂盒

1、链霉素残留酶联免疫检测试剂盒 本试剂盒采用竞争酶标免疫法定量测定蜂蜜、肉类及牛奶中的链霉素残留。试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔包括标准试验，如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。1概要 链霉素是一种被广泛应用于动物养殖的抗生素。高浓度的链霉素会产生耳毒性及危害肾脏功能等严重的副作用。为了保护消费者的身体健康,欧盟和美国规定在动物性食品中的链霉素残留量牛奶不得超过200ppb, 蜂蜜不得超过20ppb，肌肉与肝脏不得超过500ppb。过去链霉素残留一般采用气相色谱法测定。但此方法昂贵又费时，酶联免疫检测试剂盒则可通过快速简便的样品制备，检测蜂蜜、牛奶及组织中的链霉素。2测

2、定原理 测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有抗链霉素的抗体。加入链霉素酶标记物，链霉素标准或样品溶液。游离链霉素与链霉素酶标记物竞争链霉素抗体结合位点（竞争性酶免疫分析）。没有结合的链霉素酶标记物在洗涤步骤中被除去将酶基质（过氧化脲）和发色剂/四甲基联苯胺）；加入到孔中并且孵育。结合的链霉素酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应终止液后便颜色由益转变为黄色。在450nrn处测量（选择参比波长600nm）。吸光度值与样品中的链霉素浓度成反比。3试剂盒提供的试剂每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔），盒中的材料如下：1X 96孔板 (12X8孔) 包被有抗链霉素抗体6X链

3、霉素标准液,2ml/瓶1X过化物酶标记的链霉素浓缩液（蓝色溶液）1X底物（7ml）含有过氧化脲（粉红色溶液）1X显色剂（7ml）四甲基联苯胺1X反应终止液（8ml）1M硫酸1X PBS浓缩液 (15ml),，用于酶标记物稀释1X PBST浓缩液 (40ml)，加800ml蒸馏水稀释，用于洗板4需要的材料但盒中不提供4l 设备微孔板酶标仪（450nm）一均质器一离心机一恒温培养箱一振荡器10ml玻璃离心管一刻度移液管一50l，100l，1000l微量加液器42 试剂一正己烷一PBS-吐温缓冲液 (0.55 g NaH2PO4 x H2O + 2.85 g Na2HPO4 x 2 H2O + 9

4、g NaCl + 0.1 % 吐温-80, 加 1000 ml 双蒸水）一肝组织处理液I：0.36M亚铁氰化钾X 3H2O一肝组织处理液II：1.04 M硫酸锌X 7H2O5操作者应该注意之事项一反应停止液为IM硫酸，避免接触皮肤一不要使用过了有效日期的试剂，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低不要交换使用不同批号的盒中试剂6储存条件一保存试剂盒子28不要冷冻。一无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。一将不用的微孔板放进原铝箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封。7试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.6个单位（A450nm）时表示试剂可能变质

5、。8样品处理样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存1. 取1 g蜂蜜，放入离心管中，加入4.5ml双蒸水。2. 上下振荡使之完全溶解。（建议用80热水温浴试管，溶解更快更充分）3. （原料蜜3000 g离心5分钟）取上清50l进行分析。1. 用均质器均质样品。2. 称5g均质过的样品加入20ml PBS 吐温缓冲液强力混匀。3. 室温4000 g离心10分钟。(高脂肪样品需离心后取上层液体5ml加入3ml正己烷,强烈振荡5分钟。 室温4000g离心10分钟，去除顶部的脂肪层)。4. 取出上层液体用PBS-吐温缓冲液稀释1:10 （例50l样品液加450l缓冲液）。5. 取50l进行分析。8.4

6、.肝脏样品1如8.2-4稀释后，移出4ml上清液至玻璃试管。2加II 溶液，再加入0.8ml双蒸水，混匀几秒钟。3室温4000g离心10分钟。4同8.22高脂肪肉类样品方法去除脂肪（去除上层2ml液体）。5取水相，用PBS-吐温缓冲液1:8稀释（例100l样品液+700l吐温缓冲液）。6取50 l 分析测定。1. 用PBS-吐温缓冲液稀释牛奶 1:20 (例. 50 l 牛奶 + 950 l 缓冲液)。2. 取50l上清液进行分析。 9酶标免疫分析程序（室温2025条件下操作）9l测定之前注意事项1使用之前将所有试剂回升至重温 2025。2使用之后立即将所有试剂放回28。3在使用中不要让微孔干

7、燥。4在ELA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是ELA测定程序中的要点。5在所有恒温孵育过程应避免光线照射，用盖子盖住微孔板。 92 酶标记物与微孔板条a) 链霉素酶标记物为浓缩液。由于稀释的酶标记物稳定性不好，所以只稀释实际需用量的酶标记物1：15稀释（1l酶标液加14l PBS缓冲液）。在吸取浓缩液之前，要仔细地振摇，剩余的仍放置2-8保存。b) 微孔板条取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板用胶带封好，放进原袋中重新密封，2-8保存。93 标准液提供的链霉素标准液浓度为0, 0.67, 2.0, 6.0, , ppb (ng/ml)94 测定程

8、序（室温20-25条件下操作）a) 将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准和样品做两个平行实验，记录下标准和样品的位置。倒出孔中的抗体液，用PBST洗涤三次。每次洗板应加入洗液后等2分钟再倒掉。加入50l的标准液或处理好的样品到各自的微孔中。加入100l稀释的酶标记物到微孔底部，25-30孵育30分钟。倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打（每行拍打3次）以保证完全除去孔中的液体，用250l PBST充入孔中，再次倒掉微孔中液体，再重复操作两次。每次洗板应加入洗液后等2分钟再倒掉。反应底物与显色试剂以1:1混合后加入100l到微孔中，充分混合并在25-30暗处孵育30分钟。加入50

9、l反应停止液到微孔中，混合好在450nm 处测量吸光度值，必须在加入停止液后10分钟内读取光度值。10结果所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，因此0标准等于100%并且以百分比的形式给出吸光度值。标准的吸光度值（或样品）- 100 = %吸光度值0标准的吸光度值计算标准的值并绘成为一个对应链霉素浓度（ng/g或ng/ml）为半对数坐标系统曲线图，校正曲线在-ng/g(ppb)范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/g或ng/ml）可以从校正曲线上读出。请注意为了获得样品中的链霉素的实际浓度（ng/g）从校正的线上读出的浓度位必须乘以相对应的稀释系数当样品处理过程是按指示进行的，稀释系数如下；蜂蜜 5牛奶20肉类、组织 50 11灵敏度链霉素试剂盒的平均检测下限约为0.5ppb。12特异性链霉素试剂盒的特异性通过对相应的物质进行交叉反应性分析而得到。链霉素 100%与庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、青霉素、四环素