1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质精

1、第9卷第4期2002年12月中国水产科学Journal of Fishery Scie nces of ChinaVol. 9No. 4Dec. , 20021种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质陈吉祥，刘 霜，李 筠,王祥红，杜宗军，于德华，纪伟尚，（青岛海洋大学 海洋生命学院,达尔文实验室,山东青岛266003摘要 从山东省莱州海区自然发病的花鲈（L ateolobrax japan icus体内分离到1株致病性鳗弧菌，经硫酸铵盐析、DEAE 2Se pharose Fast Flow和Se phadex 2G 100凝胶层析等方法从其培养液中分离纯化了 1种胞外蛋白酶。用SDS 2P

2、A GE电泳测得蛋白质的分子量为 3617kD ,酶的最适温度为50r ,对热不稳定，70C 15min完全失去活力；最适p H为710;1mmol/L的PMSF对酶活性无影响,部分金属离子如 Cu 2+、Fe 2+、Fe 3+、Zn 2+对酶活力有抑制作用,而Ca 2+对酶有一定程度的激活作用，1mmol/LEDTA能完全抑制酶的活性,表明该酶是1种金属蛋白酶。关键词：鳗弧菌；胞外蛋白酶；分离纯化；理化性质中图分类号:S941142文献标识码:A-8737-05收稿日期:2001-11-221基金项目：国家自然科学基金资助项目（39870581 ;英国达尔文项目(162/8/065 1作者简

3、介：陈吉祥（1963-男,副研究员,博士后,从事海洋微生物学 与免疫学1子，已从霍乱弧菌、创伤弧菌-34从11种胞外蛋白 酶，证明其对虹 鳟；Lamas利用鳗弧菌及其胞外蛋白产物对虹鳟进行腹腔注射后,虹鳟表现出极为相似的症状。肖慧等6从山东沿海养鱼场发病鱼的体内分离到1株致病性鳗弧菌,感染实验表明该菌株对花鲈（L ateolabraxjapanicus等海水养殖鱼类有较强的致病性,常伴有严重的血管出血及组织损伤、出血等病症。本研究 从其胞外产物中分离纯化了1种胞外蛋白酶，并进行酶的理化性质研究，以探讨该菌胞外产物对鱼类 组织损伤及致病作用的机制。1 材料和方法111实验菌株致病性菌株 W -1

4、分离自山东省莱州湾海区发病的花鲈（L ateolabrax jap a nicus，经细菌形态学、Biolog系统鉴定为鳗弧菌（V ibrio an 2guillarum。112 试剂及仪器DEAE 2Se pharose Fast Flow、Sep hadex 2G10C购自Pharmacia公司,SDS、丙烯酰胺、牛血清蛋白、N , N 亚甲基双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R -250、PMSF等购自上海生物工程公司，其余试剂为国产分析纯沪西仪器厂,UV -730紫外分光光度计购自日本岛津公司。蛋白层析系统购自上海,D YY - m垂直板电泳仪购自北京六一仪器厂。113 实验方法2216E海水液体

5、培养基,培养温度28C ,培养时间24h ,振荡频率为180r/min。培养物于4C 5000r/min离11311细菌培养及胞外产物获得细菌的培养用心10min ,收集上清液,再分别用0145um和0120卩ma膜过滤,滤液-20r保存备用。11312 酶的分离纯化（1硫酸铵盐析将上述培养过滤液取出置室温融化后,缓慢加入（N H 4 2SO 4粉末至80%饱和度4C过夜,于10000r/min 离心 15min，收集沉 淀，并溶解于 40mL 0. 02mol/L p H 718 的 Tris 2HCl缓冲液,于4C条件下透析24h ,其间充分换水并搅动。最终体积50mL左右。(2 DEAE

6、 Sep harose Fast Flow层析将透析I.液直接加入经0102mol/L P H 7. 8Tris 2HCl缓冲液 平衡好的DEAE -Sepharose Fast Flow柱（110cm Wcm ,用含00. 5mol/L NaCl的相同缓冲液梯 度洗脱，流速 24mL/h ,每管1mL收集洗脱液,测定蛋白吸收和酶活力。（3 Sephadex G 210（柱层析将收集的上述酶 溶液充分透析,并用PEG浓缩至体积为6mL左右,然后加入到用0102mol/L p H 7. 8Tris 2HCl平衡的SephadexG 2100柱（1cm W0cm。用相同 缓冲液洗脱，流速15mL/

7、h ,每管1mL收集洗脱液，测定蛋白吸收和酶活力。收集酶活力集中部分，冷冻干燥。11313 酶活力测定参照Inamura方法4,以偶氮酪蛋白为底物。具体方法为015mL偶氮酪蛋白溶 液（5mg/mL , p H 8. 0Tris 2HCl缓冲液配制,加入011mL 酶溶液,再加入014mL双蒸水,混匀后于25C保温20min。加入5%的三氯乙酸 溶液315 mL ,于室温3000r/min离心5min，收集上清加入015mol/L NaOH溶液4.5mL ,于 440nmOD值。在该条件下OD值每增加11个酶活力单位（U 。11314Brad 2 ford 方法进行7,。11315SDS 2P

8、AGE 蛋白酶的分子量测 定采用SDS 2PA GE垂直板电泳法：浓缩胶浓度3%,分离胶浓度10%,考马斯亮蓝R 2250染色，中分子量标准蛋白包括磷酸化酶B、牛血清蛋白、卵清蛋白、羧肽酶、蛋清溶菌酶。11316温度对酶活性的影响按11313方法在不同温度下测定酶活力，确 定酶的最适温度，另外将蛋 白酶溶液于不同温度保温，每隔15min取样并迅速 冷 却到室温，再测定酶的活力，确定温度对酶活力影响。11317 pH对酶活力的影响分别以不同P H的缓冲液配制底物并稀释酶液，再按11313方法测定酶 活力，确定酶的最适P H。11318酶抑制剂及金属离子对酶活力影响将各种酶抑制剂及金属离子分 别加

9、入到酶溶液中，于25r保持10min ,再用常规方法测定酶活力，并计算酶的活力剩余。2 结果211鳗弧菌蛋白酶的分离纯化鳗弧菌蛋白酶粗酶液经硫酸铵盐析后，在DEAE 2Sepharose柱层析中， 2 峰，在 Sep hadex G100睥,1,性为15U/, 4142,酶的收率为根据该酶在SDS -PA GE电泳中的迁移率，通过作图法求得酶的分子量 3617kD （图 1。213 温度对酶活力的影响该酶的最适反应温度为50r （图2 ,是一热不 稳定酶，温度较高时，随时间延 长,活力部分丧失,超过70r时15min酶活力即完全丧失（图3。214 pH对酶活力的影响该酶的最适P H为710,P

10、 H 1041001001100硫酸铵沉淀Ammon ium sulfate501001126 1069166 104621641135DEAE 2se pharose fast flow 柱层析DEAE 2se pharose fast flow6100719205212005411073108Sep hadex G 210（层析 Sep hadex G 2100 2810041971052196 05251234142 913陈吉祥等：1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质Ml Ui nHH汀a 11 10图1 SDS 2P AGE电泳测定鳗弧菌胞外蛋白酶的分子量Fig. 1 Mole

11、cular w eight an alysis of p rotease fromV. an guillarum by SDS 2P AGE.A 1标准分子量蛋白：磷酸化酶b （97400,牛血清白蛋白（66200,卵清蛋白（42700 ,碳酸酐酶（31000 ,溶菌酶（14400 ;B 1鳗弧菌蛋白酶A. Sta ndard molecular weight p rotei ns :P hos phorylase b (97120m 100400 , Bovi ne serum ablumin (66200 , Ovalbumin b (42700 , Carb on ic an 2hydr

12、ase (31000 , Lysozyme (14400 ; B. P rotease from .an gillarum.图2 鳗弧菌胞外蛋白酶的最适反应温度Fig. 2Op timum temp erature of p rotease from V. an guil 2 larum 215 酶抑制剂和金属离子对酶活力的影响 如表2所示,SDS可部分抑制酶的活力,2mol/L的Urea对酶活力影响不大,而增加到8mol/L时酶活力部分丧失;1mmol/L的PMSF对酶活力无影响,1mmol/L的ED TA完全抑制酶的活性MUSB?120T* lAA。部分金属离子对该酶有一定的抑制作用，其中

13、Cu 2“ *2Fe 2+、Fe 3+、Zn 2+抑制作用较为明显，而Ca 2+对酶有一定程度的激活作用俵3。图3 温度对鳗弧菌胞外蛋白酶稳定性的影响Fig. 3 E ffects of temp erature on stability of p rotease fromV. an guillarum图4 鳗弧菌胞外蛋白酶的最适pHFig. 4Op timum pH of p rotease from V. an guillarum W -1表2 抑制剂对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响T able 2 E ffects of in hibitors on V. an guillarum W 21pr

14、o 2tease抑制剂In hibitor浓度/(mmol ? L -1Concen trati on酶活力/(U ? mL -1En zyme activity相对活力/%Relative activity影响Effect对照Control 9200100100EDTA 0110595064167-11007* 400100-SDS 011735079189-1100265028180-Urea 200092001001008000695075154-PMSF011095001001001009500100003 讨论胞外蛋白酶被认为是许多细菌病原的毒力因子，但不同的细菌所产生的胞外蛋 白酶

15、不同，即使同一菌种的不同菌株其胞外蛋白酶也有一定的差异23中国水产科学Miyoshi等8从创伤弧菌（V ibrio v ul nif icus分离得 到一种金属 蛋白酶,其 分子量为45kD ; Arnesen等9发现杀鲑气单胞菌（Aeromonas sal monici dia的个 别菌株胞外产物含有高分子量（89100kD和低分子量（37kD的2类蛋白酶,而大 部分菌株只有 高分子量蛋白酶，提纯后的低分子量蛋白酶是一种 金属蛋白酶，能被ED TA和过量的Zn 2+所抑制。Inamura等4从一株致病性鳗弧菌胞外产物中分 离到的蛋白酶分子量为36kD，该酶的最适P H为7 8,最适温度50C

16、 ,能被EDTA所抑制。Farrell等10通过硫酸铵盐析、DEAE 2Se pharose层析、Sepharcryl S 2200层析及DEAE高效液相层析从鳗 弧菌514分离纯化到分子量为 38kD和40kD的2种蛋白酶,前者在p H中性偏碱的条件下保持最大 活力,对丝氨 酸、酪氨酸或酸性蛋白酶抑制剂不敏 感,而被ED TA所抑制,属于金属蛋白酶。表3 金属离子对鳗弧菌胞外蛋白酶的影响T able 3 E ffects of metal ions on V. an guillarum W 212 tease抑制剂In hibitor浓度/(mmol ? L -1酶活力/(-Effect对照

17、Con trol9200100100CaCI 201109550103126+ 110010600115100+ Zn SO 40110275029185- 11001501163-MgS0 40110790085187-1100755082106-FeS0 40110725078180- 1100360039130-FeCl 30110500154-1100160017139-CuSO 40110400143-110000-本实验从鳗弧菌 W -1培养液分离到的胞外蛋 白酶分子量为3617kD ,是一热不稳定性蛋白酶，丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶无抑制作用，110 mmol/L的ED T

18、A能使酶活力完全丧失，说明该酶 不属于丝氨酸蛋白酶类，而是一种金属 蛋白酶；金属离子Cu 2+、Fe 2+、Fe 3+、Zn 2+、Mg 2+等都对该酶具有抑制作用，而Ca 2+对酶有一定的激活作用，可能与活性部位金属离子的取代或位阻作用有关；在酸性环境酶活力迅速丧失，在P H 610保持较高的酶 活性，在碱性条件下 酶活力较稳定，该金属蛋白酶与Farrell 10分离的低分子量组分相似。各种胞外蛋白酶通过不同方式对宿主发生作用，如霍乱弧菌金属蛋白酶可破坏 宿主细胞受体，切断和激活霍乱毒素A亚单位，并能降解肠粘膜以利 于霍乱毒素 的作用；创伤弧菌金属蛋白酶能通过降 解基质膜W型胶原蛋白引起溶血

19、反应；嗜 水气单胞 菌胞外蛋白酶能引起鲫鱼的败血症症状 11,有关鳗 弧菌W -1胞外蛋白酶的作用，我们将另文报道。参考文献：1 Booth B A , Fi nkelste in M B , Fin kelste in R A . V ibrio cholerae Soluble haemagglut inin/p rotease is a metalloe nzyme J.l nfect Immun ,1984, 42:639-644.2 Miyoshi D L , Nakazawa H , K awata et al. Characterizati on of the hemorrhag

20、ic react ion ibrio v ul nif icus metallo pro 2 , a Jnfect Immune , -4855.,等1嗜水气单胞菌胞外蛋白酶 EC 2 J1南京农业大学学报,1996,19 (3 :88-9414In amura H , Nakai Tand Muroga K. An extracellular p rotease p roduced by V ibrio an guillarum J.Bull Jap Soc Sci Fish ,1985,51(2 :1915-1920.5 Lamas J , San tos Y , Devesa S , e

21、t al. A comp aris on of p athoge ni 2 cal cha nges caused by V ibrio an guillarum and its extracellular p roducts in rain bow trout (On corhy nchus mykiss J .Fish P athology , 1994, 29:79-89.6肖 慧，李 军,王祥红，等1鲈鱼苗烂鳃烂尾病病原菌的研究J1青岛海洋大学学报11999,29(1 :87-9317 Bradford M M. A rap id and sen sitive method for t

22、he qua ntifica 2 tio n of microgram qua ntities of p rote in utiliz ing the principle of p rote in 2dye binding J.A nalBiochem , 1976,72:248-254 8 Miyoshi N , Shimizu C , Miyoshi S , et al. P urification and charac 2 terizati on of V ibrio v ul nif icus p rotease J.Microbiol Immunol ,1987, 31(3 :13-

23、25.9 Arn ese n A , Eggset G , J rge nsen T . P artial p ruificati on and characterizat in of extracellular metall op roteases from Aerm onas sal monici da spp.Osalmo ni cida J.J Fish Dis , 1995, 18:283-295.10 Farrell D H , Crosa J H. Purificati on and characterizatio n of a se 2 creted p rotease fro

24、m the p athoge nic mari ne bacterium V ibrio an 2 guillarum J.Biochemistry ,1991,30:3432-3436. 11储卫平，陆承平1嗜水气单胞菌胞外蛋白酶对鲫鱼的致 病性J1南京农业大学学报,2000,23(2 :80-841123第4期陈吉祥等:1种致病性鳗弧菌胞外蛋白酶的分离纯化及性质Purif icati on of an extracellular p rotease fromVibrio an guillarum and its p hysicochemical prop ertiesCHEN Ji 2xi

25、a ng , L IU Shua ng , L I Yun , WAN G Xia ng 2ho ng ,DU Z ong 2jun , YU De 2hua , J I Wei 2sha ng ,(Darwin Laboratory , College of Marine Life Scie nces , Ocea n Un iversity ofQin gdao , Qin gdao 266003, ChinaAbstract :A strain of V ibrio an guillarum W -1was isolated from the diseased sea perch (L

26、ateolabrax japoni 2 cus in Laizhou Bay , Shandong Province , and an extracellular p rotease was p artially p urified from the culture so 2 luti on of the V .an guillarum by ammon ium sulfate , DEAE 2ep harose fast flow and Sep hadex G -100.The re 2 sults show that , the molecular weight of the p urified en zyme from V .an guillarum by SDS -PA GE is 36. 7 kD ; the op timum temp erature for the en zyme activity is 50 C ,and the en zyme is heatlabile that it would en tire 2 ly lose its activity in 15min at 70 C ; the op timum p H is 7. 0;1mmol/L of ED TA and some metal ions (Cu 2+,Fe 2+