人及哺乳动物受精早期的糖类调节-- 生理学

1、人及哺乳动物受精早期的糖类调节- 生理学哺乳动物受精早期的重要步骤是精卵识别（或结合）以及精子与卵透明带（ZP）的结合。对应配子膜上存在的互补分子参与了精卵相互作用。虽然目前对于互补分子的化学性质还了解得很小，但越来越多的研究表明受精过程中精子获能和精卵识别是由糖类调节的，即糖蛋白在生殖系统中起重要作用。一些聚糖中的糖原部分可调节细胞粘附包括精卵识别和结合以及精子输卵管粘附和子宫胚胎着床。若干类聚糖，包括高甘露糖或杂合型聚糖，唾液酸糖基化和半乳糖糖基化的糖蛋白，与受精中的许多环节有关。因此，通过改变有生物活性的聚糖将有可能影响受精过程。长期以来，受精过程是生殖医学研究的热点之一。从动物受精过程

2、中得到的知识，使人的体外受精获得了成功。至今，我们对动物受精过程最了解的还是小鼠1。小鼠成功的受精包括以下几个连续的步骤：即：精子在雌性生殖道内获能。获能精子和ZP结合。顶体反应（AR）的发生。精子穿透ZP。精、卵质膜相互融合。本文讨论人及哺乳动物受精早期的糖类调节，特别是着重糖残基在精子获能和精卵识别中的重要的作用。一、精子获能精子在从附睾头到附睾尾的转运过程中，其质膜发生了很多变化2。但刚射出的精子不能立即与卵子受精，它们还必须在雌性生殖道停留一段时间并发生一系列的生化和功能上的调整，即称为获能。这些改变，包括去除精子质膜所吸附的精浆蛋白及修饰和（或）重新组合精子表面的分子，以保证精子能够

3、结合并穿透ZP。Yanagimachi和Chang最先报道了使用交配后从雌性生殖道获得的精子或使用经输卵管液培养后的附睾精子，使仓鼠卵子体外受精获得成功。这些研究表明雌性生殖道内存在一种或多种因子使精子获能。大多数研究者认为，获能可导致精子质膜上那些修饰离通道的精子质膜蛋白或糖蛋白和脂类成分发生改变，从而使精子产生获能、超激活运动和AR的跨膜离子运动。但获能的分了机制仍未完全了解。对于大部分哺乳动物，其精子在输卵管峡部发生超激活运动，然后进入输卵管壶腹部，即体内受精部位。含有牛血浆白蛋白（BSA）和能量物质的培养基能使哺乳动物精子在体外获能。精子一旦获能，则伴随着一系列生化变化，即：腺苷酸环化

4、酶的激活和环磷酸腺苷（cAMP）含量的增加。胞内pH增高。钙离子(Ca2+)内流。膜表面成分的丢失。精子质膜改变。精子对外源凝集素的结合类型发生改变。从精子外源凝集素结合特性的改变可知，其表面的糖蛋白在获能期间已发生改变。这是因为子宫和输卵管分泌物中的糖基转移酶可转变精子质膜糖蛋白。通过对暴露于精子表面的聚糖末端增加糖残基，从而改变内源的质膜糖蛋白，可望改变其外源凝集素结合特性。输卵管特异糖蛋白（OGP）对精子获能起直接作用。OGP存在时，精子获能比其缺乏时高2倍并可增加体外受精率3。另外，当OGP存在时，获能精子使同源卵子受精的能力更强。获能精子在OGP存在时，对卵巢卵子的穿透率比无OGP时

5、高3倍3。这表明输卵管及其分泌物在精子功能中起重要作用。蛋白多糖和氨基葡聚糖均可诱发精子获能。肝素可与人及一些哺乳动物精子结合。其结合能力依赖于pH、离子强度、温度以及特异受体-配体相互作用。综上所述，获能反映了成熟精子质膜上的多种变化。虽然不同动物的分子机制有所不同，但最终导致精子超激活运动发生和使其具有AR的能力。二、精卵相互作用精子获能后以十分精确的方式与ZP相互作用。对小鼠的研究表明，获能精子和ZP结合可分为两个步骤。首先，精子质膜和卵ZP可逆性松散地结合，接着则是牢固地不可逆结合。一个卵子表面可结合多个精子，但通常只有一个精子穿过ZP并和卵质膜发生融合。小鼠、大鼠和其他一些种类的ZP

6、是由ZP1、ZP2和ZP3三种糖蛋白组成，猪则存在第四种类型的ZP（ZP4）4。在卵子成熟过程中，分泌的ZP糖蛋白以非共价方式相互作用，形成纤维网络，从而构成胞外基质。这种结构使ZP具有弹性并使AR后的精子易于穿透。许多事件都由ZP调节，如：相关种属特异性的精卵识别以及获能精子与卵子结合。激活精子，导致AR发生。阻断多精受精。保护受精卵至着床前的发育胚胎1。最近几年，对影响配子质膜表面相互作用的互补分子的识别及其特异性已取得可喜进展。对于小鼠ZP（mZP）的表达表明：精子-ZP一级结合受存在于精子质膜上的特异ZP3受体和ZP3调节。精子与ZP3结合引发AR。精子-ZP二级结合即AR或AR后的精

7、子与ZP2的结合。ZP1并不直接与精子相互作用。针对性的破坏mZP3基因可导致雌性小鼠卵子缺乏ZP3从而丧失生育力5。在小鼠、仓鼠、猪和大鼠中的ZP2和ZP3都是高度糖基化的。低含量的mZP3就可使每个卵子结合的精子数下降并呈剂量依赖关系。这种抑制是由于加入的mZP3竞争性结合了精子头部质膜上互补的结合位点。ZP的聚糖成分使其具有配合活性：改变mZP3多肽结构不会破坏其抑制精卵结合的能力。不同的外源凝集素能抑制或破坏精卵结合。特异的单糖、双糖、寡糖和糖蛋白可抑制或阻断精卵结合。用外糖基化酶处理卵子可抑制或阻断精卵结合。用链霉蛋白酶降解mZP3后得到的糖多肽（1.56.0kDa）仍保留精子结合特

8、性。精子结合特性对三氟甲烷磺酸处理（导致单糖残其上N-和O-连接寡糖链的断裂）颇为敏感6。这些研究为了证明糖蛋白上的聚糖成分是精子的配体提供了重要的依据。然而，精确识别使mZP3具有配体活性的糖残基尚有争议。较早的研究中，用杏仁糖肽酶（可水解各类N-连接多糖上的-天冬酰胺-葡糖胺）处理小鼠卵子可强烈抑制精卵结合。mZP2和mZP3上存在的N-连接的高甘露糖或杂合寡糖链可能在精卵结合中起作用，并且这些寡糖单元可能是精子质膜上存在的甘露糖苷酶识别或结合部位的组成部分。它是一种属于水解断裂糖苷键的糖苷酶，这些水解酶都有相同的催化机制，最常见的是在糖残基断裂前形成酶-糖底物中间体。有证据表明存在精子酶

9、中间产物复合物：在大量的甘露糖残基被切割以前，ZP底物已形成并参与受精的下一步反应。此外，NagDas等已证明mZP2和mZP3上天冬酰胺-连接（N-连接）聚N-乙酰乳糖胺等聚糖的存在4。在其他细胞中，N-连接的聚乳糖胺链有多种多样的尾部顺序包括：Gal1、3Gal，4GlcNAc1，3Gal-R。这种-连接的半乳糖基末端顺序是由一类限度的N-连接的半乳糖基结合物包括细胞表面成分构成的。如果这种顺序在mZP3上也存在，那么它可能在精卵结合中起作用。应当指出mZP3以及用作体外试验的聚糖是由卵巢ZP纯化，而不是用输卵管中的卵子纯化得到的。虽然从卵巢和输卵管卵子纯化的mZP3在化学性质和功能上是相

10、似的，但卵子表面的结构在输卵管环境中发生了改变。这表现在与OGP或与其他糖蛋白例如糖基转移酶等结合。输卵管液中存在的糖基转移酶有可能参与了最终暴露在ZP表面的糖链的修饰。ZP糖蛋白上任何糖残基在输卵管中的改变，对精子受体活性即识别和结合这些糖残基都可能产生影响。这表明在输卵管微环境中的聚糖和它的互补受体可能与体外精卵结合试验不同。最近研究已确定了一些精子上作为受体的蛋白。其中半乳糖基转移酶。SP56，ZP受体激酶（ZRK）和精子粘附分子参与了精子-ZP一级结合，而PH-20蛋白，顶体酶原，SP38和SP17则参与二级结合7。精子-ZP一级结合引发精子与ZP的相互作用并激发AR，而精子-ZP二级

11、结合使精子粘附于ZP并穿透ZP。存在于精子表面的1-4半乳糖基转移酶不仅具有酶的活性，同时还作为一个凝集素识别具N-乙酰葡糖胺未端的寡糖链配体。纯化的半乳糖基转移酶，半乳糖基转移酶抑制剂和抗-半乳糖基转移酶的抗体可抑制精卵相互作用。已有研究表明半乳糖基转移酶的特异性作用于ZP3。半乳糖基转移酶可能还存在信息传递功能。过度表达半乳糖基转移酶的转基因小鼠精子比正常精子更多地结合ZP3，且大部分发生AR6。SP56系56kDa的外周膜蛋白。它最初是在小鼠精子中发现的，并能与纯化的小鼠ZP3和ZP3的糖多肽共价结合。特异单克隆抗体分析表明SP56存在小鼠精子头部背面。纯化的SP56可与小鼠卵结合从而抑

12、制体外精卵结合。ZRK是一个跨膜受体且具酪氨酸激酶活性。酪氨酸磷酸化是精子受精所必需的，抑制酪氨酸蛋白激酶活性可阻断受精。用单克隆抗体mAb97.25发现了95kDa的精子蛋白参与精卵相互作用。该精子蛋白是酪氨酸磷酸化且存在于精子表面顶体区域。其多肽成分可竞争性抑制人精子-ZP相互作用。精子粘附分子家族（1216kDa）可和包括ZP糖蛋白在内的一些配体结合。当精子获能后，大部分精子粘附分子都丢失了，但还有一些仍存在于精子表面和ZP发生结合，其中包括AWN-1，AQN-1和AQN-3（精子粘附分子）。但这些分子是否普遍存在于哺乳动物精子中，是否是精子-ZP结合所必须，还不清楚。PH-20是由糖基

13、磷脂酰肌醇锚定的质膜蛋白，参与精子-ZP二级结合。它存在于精子表面头部后顶体区域和顶体内。前者在精子穿过颗粒细胞时起作用，而后者则在二级结合时与ZP结合。PH-20广泛存在于哺乳动物精子中，且是高度免疫的基因蛋白，因此有助于避孕疫苗的研制。顶体酶原很早就被人们认为参与精子-ZP二级结合。当AR发生时，顶体酶原受ZP的调控转变成顶体酶。由于它的ZP结合特性和水解蛋白质的特性，顶体酶原被认为在精子结合和穿透ZP中起重要作用。猪ZP2和顶体酶原发生结合，并且已得到顶体酶原与ZP结合的残基结构9。牛精子中和顶体酶原结构相似的SP38，与其有相同的结合特性。SP38及来源于SP38和顶体酶的寡多肽可抑制

14、SP38-ZP的结合。SP17上有一个重要残基被认为是C-型凝集素半乳糖结合所需区域。Richardson等认为在AR时，SP17暴露于兔精子表面并移动到精子头部与ZP2结合。此外，人精了含有-D-甘露糖苷糖酶和一个甘露糖结合蛋白。这些大分子都具有和ZP上含甘露糖的寡糖连结合的受体样作用。人精子抗原FA-1和选择素（selectin）样分子10能与同源ZP结合。小结精卵相互作用乃当前生殖医学研究的前沿领域之一，方兴未艾。它们通过互补分子即受体（精子上）-配体（ZP上）机制激发精卵识别，亦即ZP表面糖蛋白和精子质膜上互补糖类结合酶和外源凝集素样分子在精卵相互作用中起重要作用。但这些受体和配体的化

15、学性质及其特性，尚未被阐明。精卵识别（结合）是通过单一个还是多个受体-配体相互作用；体外精卵结合试验中所确定的互补分子是否与输卵管中的相同，尚待深入研究。虽然受精事件因种而异，其进行的顺序也不尽相同，但精子获能、精卵相互作用、顶体反应的发生等机制还是很相似的。这些事件在受精早期至关重要。然而调节上述事件的机制细节，仍是生殖生物学一个未解决的基本问题。ZP聚糖的巨大差异提示，某些配体（聚糖）-受体相互作用在配子相互作用和成功的受精前就起作用了。最近研究表明精子和ZP的最初识别过程是一个复杂的结合过程，包括多种精子蛋白与ZP3的结合11。因此，深入地了解获能、精卵相互作用和顶体反应机制，必将使我们

16、获得更多的方法以确定糖类残基及其互补分子的特性。参考文献1 yanagimachi R et al. Physiol Reprod,1994:189-3172. tulsiani DRP et al. Dev Biol ,1995;167:584-5973. verhage HG et al .Biol Reprod ,1998;58:1098-11014. nagDas SK et al. Biol Reprod ,1994;51:262-2725. liu C et al. Proc Natl Acad Sci USA,1996;93:5431-54366.Daulat rP et la. Biol Reprod ,1997;57:487-4947. mc