肝缺血再灌注损伤后电解质变化对心肌细胞超微结构的影响

1、肝缺血再灌注损伤后电解质变化对心肌细胞超微结构的影响    【关键词】  肝疾病；,肠；,缺血再灌注损伤；,肌细胞,心脏；,电解质；,显微镜检查,电子摘要: 目的观察大鼠肝门阻断后缺血再灌注（IR）损伤对心肌细胞超微结构的影响。方法大鼠气管切开机械通气，监测肺动脉压（PAP）。72只大鼠随机分为对照组（A组）、肝血流阻断组（B组）及门静脉转流下肝血流阻断组(C组)。于IR前和IR后1，6 h取左心室前壁心肌组织数块。血气分析肝门阻断期间门脉血pH和电解质；光、电镜下观察心肌细胞形态学改变。结果  与A组比较，B，C组IR后PAP显著升

2、高（P<0.05），但C组较B组更快恢复至阻断前水平。肝门阻断期间，B组pH降低显著（P<0.05，）；K+较IR前升幅超过1倍（P<0.01），IR后下降，但6 h时仍处于较高水平（P<0.05）；Ca2+呈进行性下降。C组变化与A组比较差别无统计意义（P>0.05）。电镜观察，A组心肌细胞超微结构正常；B组心肌细胞6 h可见线粒体水肿，心肌肌丝断裂，细胞间隙增大，部分心肌细胞可见坏死区域，结构崩解；C组IR后部分心肌肌丝模糊，线粒体肿胀，心肌细胞局灶性坏死。结论  肝门阻断后门脉内酸性物质和高钾血症直接抑制心肌收缩力，减少心排，肠道IR损伤是引起心肌

3、细胞超微结构损害的主要因素。关键词: 肝疾病； 肠； 缺血再灌注损伤； 肌细胞，心脏； 电解质； 显微镜检查，电子ABSTRACT: ObjectiveTo investigate the myocardial morphologic changes after hepatic portal occlusion(HPO) ischemareperfusion injury. Methods  Rats were mechanical ventilated. The animals were randomly divided into 3 groups：(1)control group

4、 was shamoperated; (2)HPO group, the animals were subjected to reperfusion after 60 min hepatic portal occlusion; (3)bypass group, HPO 60 min while bypassed by caudal lobe.  The animals in each group were killed before reperfusion and the end of reperfusion 60 or 360 min.    

5、;    The hemodynamics and portal vein blood gas analysis were measured, the myocardial cell morphology were studied by optics and electron microscopy.Results  Hemodynamics data in both B,C groups showed low cardiac output during HPO phase, and pulmonary artery pressure(PAP) was h

6、igher than group A after reperfusion（P<0.05）, but in group C the PAP return to baseline was faster than group B（P<0.05）. Compared with groups A and C, the portal vein pH in group B decreased significantly during HPO but immedially return after reperfusion, simultaneously the K+ remarkablely in

7、creased and lasted to 6 h; the Ca2+ decreased gradually（P<0.05）.  The electron microscopy showed the myocardial morphology in group A was normal, group C appeared myofilament broken ,mitochondrium swelling,and some cell focus necrosis. Group B was serious than group C, such as mitochondrium

8、edema, there were myofilament and muscle rod broken, cell spaces increasing, and local necrosis or disintegration.Conclusion The ischemiareperfusion injury afer HPO may affected myocardial cell and inhibit cardiac contractibility. The interruption of bowel blood stream and reperfusion of intestinal

9、metabolites may be the principal cause of myocardium damage.KEY WORDS: liver diseases; intertines; ischemia reperfusion injury; myocyes,cardiac; electrolytes; microscopy, electron肝移植和肝门阻断（hepatic portal occlusion，HPO）手术中肝脏缺血再灌注(ischemiareperfusion，IR)损伤是常见的病理生理表现，其中门静脉阻断后肠道 IR损伤被认为是术后多脏器功能不全（MOSF）的引

10、擎1，导致肝外多脏器功能损伤。笔者观察HPO后肝和肠道IR损伤对心肌细胞超微结构的影响。1  动物与方法1.1  动物分组        选取体质量200250 g成年SD雄性大鼠福建医科大学实验动物中心，合格证号SCXK(闽20040008)，术前禁食12 h。10%水合氯醛3 mL/kg腹腔麻醉，气管切开机械通气（TKR200A，江西特力小动物呼吸机）。肝素500 IU/kg静脉注射。常规消毒，腹部正中切口入腹，离断肝周韧带，中断肝脏侧支循环。经右侧颈外静脉将PE50导管置入后连接压力换能器（Date

11、x多功能监测仪，芬兰），确认至肺动脉后固定导管并测定肺动脉压（PAP）。股动脉置管监测平均动脉压（MAP）和心率（HR）。灯烤保温，保持肛温3637 。                所有大鼠随机分3组：（1）对照组(A组，n=24)，经腹正中切口入腹，切断全部肝周韧带；不作肝血流的阻断。（2）肝血流阻断组（B组,n=24），Pringle'法阻断肝十二指肠韧带，使包括尾叶在内的全部肝叶完全缺血2，60 min后开放灌注，肝复流后切除尾叶

12、(约占全肝5%)。（3）门静脉转流下肝血流阻断组（C组,n=24），参照文献3分别阻断肝左中叶及右叶肝蒂，保留尾叶血供作为门脉回流通道；60 min后灌注，肝复流后切除尾叶。每组各有8只大鼠分别于IR前、IR后1，6 h处死，取左心室前壁心肌组织数块。1.2 方法全程连续监测。以阻断前数值为基础值，并于各时间点取值3次求均值。处死前取门脉血1 mL送检血气分析（M3562A,德国Philips公司；测试条美国Irma Trutoint公司，批号139903）。冰面上操作,取左室前壁心肌组织数块，各1 mm×1 mm×1 mm，3%戊二醛1.5%多聚甲醛前固定，1%锇酸1.5

13、%亚铁氰化钾后固定，酒精丙酮脱水，环氧树脂618包埋剂包埋；超薄切片80 nm，醋酸铀、枸橼酸铅染色，透射电镜(日立Hu12A型、飞利浦208型)观察、细胞表面和内部超微结构改变并摄像（福建医科大学电镜室）。取左室前壁心肌组织数块，置于中性福尔马林液中固定过夜，常规取材、脱水、石蜡包埋、HE染色、常规切片观察。1.3统计学处理       采用SPSS 11.0统计软件分析，计量资料以x±s表示。组间比较采用单因素方差分析，组内比较为配对t检验；P0.05为差别有统计学意义。2 结果2.1 MAP、HR、PAP、pH值及电解

14、质的比较        各组再灌注后PAP显著升高（P<0.05），B组6 h后仍未恢复至阻断前水平（P<0.05），C组再灌注后即已接近阻断前水平，和A组差别无统计学意义（P>0.05）（表1，图1）。表1 3组MAP、HR、pH值及电解质阻断前和再灌注前后的变化（略）2.2 病理改变        光镜下各组未见明显的特异性改变，均未见中性粒细胞（PMN）侵润。仅B组再灌注1 h后心肌血管腔内见少量炎症细胞侵润,6 h后部分心肌组织呈

15、灶性变性。透射电镜下病理改变见图2。3 讨论                无肝期是肝脏移植围术期复杂病理生理改变的根源之一。实验中，HPO模拟无肝期的病理过程。HPO不仅涉及肝脏本身IR，同时肠道系统的IR更需重视。Liu等发现在HPO>120 min，80%大鼠死于肝外多脏器损伤，20%死于肝功能衰竭4。           &

16、#160;    IR开始后，门静脉内乳酸堆积、高钾血症等对心肌收缩力的直接抑制使心排血量下降，全身低灌注，此时心肌细胞未见明显的不可逆的器质性变化；>6 h在部分心肌可见灶性坏死、结构崩解等不可逆改变。观察中，C组由于保留了肝脏尾状叶作为HPO期间门静脉的转流通路，表现出IR后心功能下降和心肌细胞结构改变轻微，提示肠道系统的IR损伤在HPO病理生理改变中有重要作用，门静脉阻断较单纯肝IR损伤对心肌结构和收缩功能影响更大。内脏IR损伤是以肠源性的氧自由基（ROS）为中心引起的连锁反应，多因素造成原发和远隔组织损伤1。IR后活性氧代谢产物(ROM)形成5，RO

17、M可直接破坏各种生物脂膜、核酸、酶和受体，导致细胞功能损害甚至永久性坏死。HPO后心肌细胞超微结构也出现了器质性改变，IR后早期以线粒体肿胀等可逆性变化为主；>6 h有灶性坏死等不可逆改变出现。ROS来源于IR损伤后肠聚集的PMN，提高微循环通透性后导致细胞功能的破坏，同时激活在IR组织血管床中循环的 PMN，介导远隔器官的损伤，不断释放超量的细胞因子，对机体形成愈加强烈的持续刺激，把有限的炎症反应变成失控的炎症反应和多器官功能障碍综合征（MODS）。           

18、60;    IR损伤后激活电压依赖性钙通道，Ca2+和Na+的内流增加；代谢性受体与G蛋白耦联介导细胞内第二信使的表达引起胞内钙库释放Ca2+，引起细胞内Ca2+超载。细胞内Ca2+浓度增加可激活蛋白酶、脂肪氧合酶A2等多种重要酶，并促进自由基形成，故细胞内钙超载被认为是细胞死亡的最后共同通路。本研究HPO IR>6 h Ca2+水平持续降低，可能和Ca2+细胞内移相关。                由于肠

19、道系统的IR损伤是造成HPO后肝外脏器损伤的重要原因，文献报道了几种门静脉转流方案（如门体、脾髂、脾腋转流等）6；有文献报道应用缺血预处理的方法可对IR损伤起到保护作用7。本研究中的动物实验模型，保留肝脏尾状叶的门静脉转流方案，简化了实验步骤和设备，减少手术损伤和转流相关性并发症，在实验中较好地避免了门静脉血淤积、肠道IR，IR后心肌细胞的损害程度小于全肝阻断的影响。有研究表明，该转流条件下即使肝缺血时间长达90 min，7 d动物全部存活，而全肝血流阻断30 min后，动物肝脏再灌流损害显著，其坏死灶显著增多，7 d死亡率高达60%3。笔者认为，HPO后门脉内酸性物质和高钾血症及细胞内钙超载

20、直接抑制心肌收缩力，减少心脏射血；肠道IR损伤是引起心肌细胞超微结构损害的主要因素，这可能也是后期心功能不全的器质性原因之一。参考文献：1郑晓春,陈彦青,黄风怡,等. 抗坏血酸对肠缺血再灌注损伤后大鼠肺的保护作用J. 中华麻醉学杂志, 2005,25（8）:606607.2Hiroshi I,Noribiko K,Yasubiko S,et al. Pringle' maneuver and selective inflow occlusion in living donor liver hepatecomyJ. Liver Transplantat, 2004,10(1):771778.3董家鸿,何效东,李        昆,等. 大鼠门静脉转流下耐受入肝血流阻断