动力学机理研究

1、磷脂酶D催化合成磷脂酰丝氨酸反应抑制动力学的研究摘 要：磷脂酶D（PLD）催化磷脂酰胆碱（PC）磷脂酰基转移合成磷脂酰丝氨酸（PS）的反应在油-水两相体系中进行，此法是目前制备PS最为广泛的一种方式，但其机理尚不明确。本文在PH 5.5，温度28，200 rpm/min的恒温摇床中，进行不同浓度PC在PLD催化下发生的转磷脂酰基反应，发现随着PC浓度的增加，PC的转化率及PS的收率均呈下降趋势。为验证PC转化率及PS收率的下降是由于生成胆碱浓度的增高所影响的，继而在不同PC浓度下分别加入3、6mM的抑制剂（胆碱）进行转磷脂酰基反应，探讨胆碱在PLD催化下的抑制机理，建立了无胆碱抑制和有胆碱抑制

2、时的动力学模型，实验结果很好的符合了所提假设，对PS的工业化生产具有指导意义。关键字：磷脂酰丝氨酸；磷脂酰胆碱；磷脂酶D；转磷脂酰基反应Inhibition kinetics of conversion of phosphatidycholine to phosphatidylserine by phospholipase DAbstract: The synthetic reaction of phosphatidyserine(PS) from phosphatidylcholine(PC) catalyzed by phospholipase D(PLD) was carried in

3、oil-water two phase system. It is the most extensive widely-used way for the preparation of PS, but the reaction mechanism of transphosphatidylation and hydrolysis by PLD remains unclear. The conversion of PC to PS was carried out at a Constant temperature shaking table with the speed of 200 rpm/min

4、, pH 5.5 and 28, with an increase in the PC concentration, the conversion of the PC and the yield of the PS all decreased. The effect of the high choline concentration for the decrease was investigatedby the addition of 3、6mM depressor (choline) in the transphosphatidylation system with different co

5、ncentration of PC,respectively. The inhibitory mechanisms of choline in PLD catalytic reaction was explored, then we described two reaction models which are free inhibition intrinsic kinetic model and inhibition intrinsic kinetic model, The experimental data agreed well with the simulation results,

6、these model may serve as a predictor for the industrialized production of the PS.Key words: phosphatidylserine; transphosphatidylation; kinetic model; inhibition;磷脂酰丝氨酸（PS）是一种体内分布广而功能独特的稀有磷脂，研究表明，PS能够增强神经递质效率，促进脑部信息传递，激发大脑活化状态，具有促进用脑疲劳的恢复、改善记忆力、预防老年痴呆症、治疗儿童多动症、平衡情绪、缓解抑郁等多种疗效1-4。PS已成为重要的保健品，市场需求不断扩大5

7、。然而，天然磷脂中PS含量很低，利用磷脂酶D（PLD）催化的磷脂酰基转移反应由廉价的大豆磷脂（磷脂酰胆碱，PC）合成PS是受到研究人员广泛重视的工艺。典型PLD催化的磷脂酰基转移反应是水-有机溶媒双液相体系。据报道，尽管在大大过量的磷脂酰基受体L-丝氨酸存在下，产物收率仍难于进一步提高，这不仅增加了原料、酶的消耗，也影响了产品PS的纯度。为了掌握磷脂酰基转移反应的规律，需要研究磷脂酶D催化磷脂合成PS过程中，酶、受体和底物磷脂的动力学行为。Ogino等人发现在链霉菌属磷脂酶D催化的磷脂酰基转移反应过程中，受体乙醇胺存在抑制，而甘油无抑制效应6，说明不同受体其抑制效应不同；而据Juneja等报道

8、，丝氨酸无抑制效应7；Damnjanovi J等总结了磷脂酰基转移反应过程的受体效应，认为无抑制效应时，受体的浓度应该足够高以确保高效，并有效抑制与转磷脂酰基反应相竞争的底物水解作用8；为满足工业化生产需求，人们期待通过增加底物PC浓度达到高效生产PS的目的，结果发现随着PC浓度的增大，其转化率反而有所下降，Juneja等认为磷脂酶D催化反应的副产物胆碱对转磷脂酰基反应具有抑制效应9。不同来源的磷脂酶D具有高度保守的序列结构，所包含HKD模体构成活性部位10-12，而 GG/GS 模体构成结合部位13,14。反应被认为是两步ping-pong机理，首先组氨酸残基咪唑-N亲核进攻底物磷原子形成共

9、价结合的磷脂酰-酶中间物，然后中间物被水解或醇解。综上所述，本文着眼于双液相磷脂酰基转移反应中的受体底物大量过量事实，提出了受体底物预饱和假设，关联副产物胆碱抑制效应，建立动力学模型，并对其中的模型参数进行了数值计算，为优化反应条件并提高产物收率提供理论依据。1 材料与方法1.1仪器与设备电子天平（T-114，美国Denver），pH计（PB-10，德国Sartorius），扫描仪（Pro800，日本Canon），碘蒸气染色缸（200cm×400cm，上海信谊）；恒温摇床（KYC 100B，上海福玛）；薄层展开缸（PQ，上海信谊）；干燥箱（DHG-9031A，上海一恒）。1.2材料与

10、试剂PLD（比活力大于8.0 U/mg，实验室自制，方法参见文献15），大豆磷脂酰胆碱（PC-90，平均分子量760，上海复力），L-丝氨酸（无锡必胜），氯化胆碱（国药集团），薄层硅胶预制板（GF254，上海信谊）。其它化学试剂均为市购分析纯。1.3实验及检测方法1.3.1 磷脂酰基转移反应 由PC磷脂酰基转移合成PS的反应在双液相体系中进行，有机相为15.0 ml乙醚溶解一定浓度的大豆磷脂酰胆碱；水相由溶解1.05 g 的L-丝氨酸7.8 ml的0.2 mol/L醋酸盐缓冲液（pH 5.5）和0.2 ml磷脂酶D组成。有机相与水相在磨口锥形瓶中混合后开始反应，密封良好的反应瓶于28、200

11、r/min的摇床中摇振进行双相反应。一定时间间隔提取0.1 ml有机相样品，并以TCL检测磷脂组成。1.3.2 胆碱对反应的抑制作用在1.3.1的反应体系中，水相添加一定浓度的氯化胆碱，其它条件不变，测定胆碱存在下磷脂酶D催化反应过程组分浓度的变化。验证胆碱对PC磷脂酰基转移合成PS反应的抑制作用。1.3.3磷脂浓度测定反应样品的磷脂浓度采用薄层层析（TLC）法测定，有机相样品用乙醚稀释一定倍数后点样10 µL于GF254薄层硅胶预制板上，以氯仿-甲醇-水-冰醋酸（65:25:5:1，体积比）为展开剂在展开缸中展开，碘蒸气显色。TCL板用扫描仪扫描，斑点用Photoshop软件计算面

12、积及灰度值，并与标品浓度对照得到样品中磷脂的浓度。2结果与讨论2.1磷脂酰基转移反应过程磷脂酶D催化磷脂醇解 在丝氨酸存在的双液相体系（水-乙醚）中催化PC磷脂酰基转移反应生成PS。图1表示有机相PC浓度为10 mmol/L、水相丝氨酸浓度为1250 mmol/L（摩尔比为1:66.67，浓度比为1:125）时，在pH 5.5、28和摇床转速200 r/min下反应过程的组分浓度变化情况。图1 转磷脂酰基反应过程各组分浓度与时间的关系在反应初期，PC、PS、PA和Cho各物质的量呈线性变化，即反应速率可视为一个定值常数，此反应过程可视为无抑制的零级动力学反应过程。30分钟后随着反应的进行，转化

13、率升高，反应速率不断减小并趋于零，产物组成趋于一个定值常数，分析造成这一现象的原因很有可能产物胆碱对反应过程的抑制效应。2.2胆碱对磷脂酰基转移反应的抑制作用为了验证胆碱对转酯反应是否真的存在抑制效应，本实验通过向反应体系中直接加入胆碱，观察实验现象。实验结果如图2所示，两组反应除胆碱浓度外，其余反应条件均一样。图2 胆碱的加入对转磷脂酰基化反应过程的影响结果表明，胆碱的加入使得PC的转化率下降了约10%，同时PS的产率下降接近18%。分析可能造成这一现象的原因：胆碱为三甲基氨的氢氧化物，强有机碱；磷脂酶D催化水/醇解的活性部位为HKD保守基序，其中的天冬氨酸为酸性氨基酸，容易与胆碱结合生成结

14、晶盐，即胆碱与PLD结合导致PLD与底物亲和力下降，影响PC转化率及PS产率。2.3 动力学模型的导出2.3.1 无胆碱抑制的动力学模型对于低浓度PC下PLD催化的转磷脂酰基反应，由于胆碱生成量很少，对反应过程抑制不明显，本实验在采取先忽略胆碱抑制的前提下，建立反应模型。对于酶促反应来说，其反应过程总是以生成络合物的形式来实现的，对于PLD催化PC所发生的转磷脂酰基反应与水解反应可通过以下过程来实现（如图3）：基于受体底物预饱和假设，酶首先与受体丝氨酸（Ser）结合得到E-Ser；E-Ser与PC发生亲核反应生成PC-E-Ser复合物；PC-E-Ser发生转磷脂酰基反应生成PS并释放出胆碱，在

15、发生此反应的同时，PC-E-Ser还会发生水解反应最终生成PA并释放胆碱。 图3：无胆碱抑制时，酶催化PC分别发生转酯与水解反应的机理由于PC水溶性很差，而丝氨酸又只溶解在水相中，因此假设转磷脂酰基反应只发生在两相接触面上，在搅拌状况下各相中各物质浓度均匀一致，不考虑扩散引起的传质效应。以PS和PA的生成步为控速步骤，其他反应过程可以迅速达到平衡，其中E表示反应体系中的游离酶：K1=，K3= (1) RPC= (2)RPA= （3） RPS= （4）2.3.2 有胆碱抑制的动力学模型 (a) (b)图4：PC浓度对生成PS相对含量的影响。（a）,PS(2mM PC)；,PS(4mM PC)；,

16、PS(6mM PC)；,PS(8mM PC)；,PS(10mM PC)；(b),PC(2mM)；,PC(4mM)；,PC(6mM)；,PC(8mM)；,PC(10mM)由图4可知，随着PC浓度的增大，PS的相对生成含量不断下降，PC转化率也明显降低，此时无抑制动力学模型已经无法良好地预测反应过程。为探究产生这一现象的原因，胆碱抑制机理被广泛接受9。通过向酶促反应中加入定量胆碱，证实胆碱抑制机理。同时图3中无抑制动力学模型也应得到修改，结果如图5所示。图5：有胆碱抑制时，酶催化PC分别发生转酯与水解反应的机理相应的动力学方程如下：K5= （5）RPA= （6）RPS = （7）2.4 模型参数2

17、.4.1 无胆碱抑制的动力学参数采用MATLAB工具对方程（1）（4）进行处理。用龙格-库塔算法实现对速率微分方程的求解，结合最小二乘的方法拟合方程中的四个参数（平衡常数：K1、K3；反应速率常数：k+2、k+4），拟合过程基于下式： （8）其中，PCreal,i、PSreal,i、PAreal,i、Choreal,i分别为PC、PS、PA、Cho实验测定值；PCsimul,i、PS simul,i、PA simul,i、Cho simul,i分别为PC、PS、PA、Cho在对应时刻，相同条件下，软件的拟合值，所得参数值如表1所示。2.4.2 有胆碱抑制的动力学参数方法同无胆碱抑制时相同，对方

18、程（1）、（2）、（5）（7）进行求解，加入不同浓度胆碱时的动力学参数如表1所示。表1 外加不同浓度胆碱时的动力学参数 参数 外加胆碱(mM)K1k+2K3k+4K500.47231.2220.23331.1842/30.48231.3540.26311.18260.36560.48291.3590.26171.18220.365化学反应速率常数及平衡常数都是温度的函数，与浓度无关；本实验中各反应温度等条件均一致，只改变胆碱的浓度，故所求参数应保持不变，与表1结果相符，说明机理稳定。由K5可看出确实存在胆碱抑制效应，表明胆碱的加入会直接影响酶与底物的亲和力，造成酶和底物结合能力变弱，属于竞争性

19、抑制。2.5 模型评价(a) (b) (c)图6 对所提机理的验证（a，b）不同初始胆碱含量下，PC向PS转化：() 0mM；() 6mM；（c）不同初始胆碱含量下，PC浓度对PS初始生成速率的影响：() 0mM；() 6mM图（a）、（b）分别为反应体系中PC、PS含量随时间的变化情况，其中曲线是根据上文建立的模型，利用matlab软件进行数值计算得到的拟合曲线，点表示实验过程的测定值。如图所示，PC的转化速率及PS的生成速率都随初始胆碱含量的增加而减小，PC的转化率也有所降低，两者的拟合数据和实验数据吻合良好，验证了胆碱抑制假设；为了进一步验证机理的合理性，根据上述所求动力学参数表达出PS

20、的生成速率方程，在不同初始胆碱含量下进行实验，分别测定不同PC浓度对PS初始生成速率的影响，理论值与实验值如图（c）所示，在固定初始胆碱含量的情况下，PS初始生成速率随PC浓度的增加而增加，而在相同PC浓度时，增大胆碱初始含量，PS初始生成速率明显降低，计算结果和实验数据吻合良好，从而进一步验证了假设模型的合理性。3、结论 采用PLD催化磷脂酰胆碱进行酯交换反应是合成PS最有效的方法。本文通过在反应体系中加入胆碱与不加胆碱时对PS与PA生成速率的影响，建立了PLD催化磷脂酰胆碱发生转酰基反应的动力学方程。本实验中丝氨酸与磷脂酰胆碱（PC）加入的物质的量之比为100:1，反应条件为PH 5.5，

21、温度28oC，200 rpm/min的恒温摇床。由动力学实验发现，随着底物PC浓度的增大，生成胆碱的含量也在增多，胆碱与PLD结合造成PLD与PC亲和力变弱，导致PS的生成速率与PC的转化率降低。从动力学角度可知，若在反应过程中移除胆碱，则可以大大提高PS的生成量。参考文献1Suzuki S, Yamatoya H, Sakai M, et al. Oral administration of soybean lecithin transphosphatidylated phosphatidylserine improves memory impairment in aged rats.J.

22、Journal of Nutrition, 2001, 131(11):2951-2956.2Crook T, Petrie W, Wells C, et al. Effects of phosphatidylserine in Alzheimers diseaseJ. Psychopharmacology Bulletin, 1992, 28(1):61-66.3Cenacchi T, Bertoldin T, Farina C, et al. Cognitive decline in the elderly: A double-blind, placebo-controlled multi

23、center study on efficacy of phosphatidylserine administrationJ. Aging, 1993, 5(2):123-133.4Kidd P M. Attention Deficit/Hyperactivity Disorder in Children: Rationale for Its Integrative Management - ADHDJ. Alternative Medicine Review, 2000, (Oct).5冯雷刚, 周红梅, 胡光祥,等. 磷脂酰丝氨酸的应用研究J. 食品研究与开发, 2006, 09期:191

24、-193. DOI:doi:10.3969/j.issn.1005-6521.2006.09.063.6C. Ogino, Y. Yasuda, A. Kondo, N. Shimizu, and H. Fukuda, Improvement of transphosphatidylation reaction model of phospholipase D from Streptoverticillium cinnamoneum, Biochem. Eng. J., vol. 10, no. 2, pp. 115121, 2002.7Juneja L R, Kazuoka T, Goto

25、N, et al. Conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylserine by various phospholipases D in the presence of l- or d-serineJ. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism, 1989, 1003(89):277283.8Damnjanovi J, Iwasaki Y. Phospholipase D as a catalyst: Application in phospholipi

26、d synthesis, molecular structure and protein engineeringJ. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2013, 116(3):271280.9L. R. Juneja, E. Taniguchi, S. Shimizu, and T. Yamane, Increasing productivity by removing choline in conversion of phosphatidylcholine to phosphatidylserine by phospholipase D, J. Ferment. Bioeng., vol. 73, no. 5, pp. 357361, 1992.10Koonin E V. A duplicated catalytic motif in a new superfamily of phosphohydrolases and phospholipid synthases that includes poxvirus envelope proteins.J. Trends in Biochemical Sciences