手性药物对映体的毛细管电泳电化学分离检测

1、手性药物对映体的毛细管电泳/电化学分离检测许迪明谢天尧*中山大学化学与化学工程学院,广州,510275摘要本文报道了以未涂层融硅石英毛细管(50cm×75m为分离柱,以8mmol/L的柠檬酸+5mmol/L的NaOH+8mmol/L -CD溶液为电泳运行液,分离电压+12.5kV,检测电压0.80V,建立了手性药物去甲肾上腺素对映体的毛细管电泳/电化学分离检测方法,对缓冲溶液的种类、浓度、pH、分离电压对拆分效果的影响进行了讨论。关键词毛细管电泳去甲肾上腺素对映体电化学检测前言手性对映体在生理过程中的不同作用越来越被人们认识,许多手性药物的有效成分只是其两个对映体中的一种,而另外那种

2、对映体是无效或者有毒的。20世纪60年代,镇静药肽胺哌啶酮(反应停当时以消旋体用作缓解妊娠反应药物,但后来在欧洲发现曾服用此药的孕妇产下四肢呈海豚状的畸形儿,成为震惊国际医药界的悲惨事件。后来研究表明,该药的两个对映体中只有R构型对映体具有镇静作用,S构型对映体则是一种强致畸剂1。因此手性药物的研究具有重要的意义。对手性药物的分离检测是手性药物研究中关键环节,建立快速、简便、高效的手性药物分离检测方法是目前分析化学研究的一个热点和难点。目前手性对映体的分析方法包括:薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱和超临界色谱2。毛细管电泳(Capillary electrophoresis是近十年发展起来的一

3、项技术,与上述方法相比,它具有分离效能高、又可进行多种分离模式的选择、试剂和样品用量少、环境友好和相对较低的操作成本等优点,是极具潜力和发展前景的手性药物分离检测新途径新方法3。去甲肾上腺素是一种急救药,具有很强的血管收缩作用,使全身小动脉与小静脉都收缩(但冠状血管扩张,外周阻力增高,血压上升。临床上主要利用它的升压作用,静滴用于各种休克(但出血性休克禁用,以提高血压,保证对重要器官(如脑的血液供应。其结构如图1所示。其结构中含有一个手性碳原子,具有光学活性。本文采用毛细管电泳/电化学技术分离检测去甲肾上腺素对映体,取得了满意的分离效果。基金项目中山大学化学与化学工程学院第三届创新化学实验基金

4、项目(批准号:02020资助第一作者许迪明(1981年出生,男,中山大学化学与化学工程学院化学专业99级知道教师谢天尧Email:cesxty*OHOHHO NH2CH CH2 手性原子图1去甲肾上腺素对映体的结构1实验部分1.1主要仪器和试剂CES2000毛细管电泳仪(高压电源,安培检测器,毛细管电泳数据工作站,中山大学化学与化工学院研制;PHS-3C 型酸度计(上海伟业仪器厂;石英毛细管(50cm×75m i.d.,河北永年光导纤维厂;CQ-2Q型超声波清洗器(明珠电器有限公司;全自动高精度旋光仪(德国SCHMIDT+HAENSCH公司;去甲肾上腺素针剂(上海禾丰制药有限公司。1

5、.2 缓冲溶液和样品溶液分别配制以下浓度的储备液:100mmol/L柠檬酸和氢氧化钠;25mmol/L-CD。实验时,按比例各取适量以制得不同浓度和不同pH的电泳运行缓冲液。去甲肾上腺素对映体分别配成20mg/mL和 15mg/mL的储备液,进样时用缓冲溶液稀释到所需浓度。1.3 实验方法连接好毛细管电泳仪和检测装置4,毛细管柱在使用前依次用0.1mol/L NaOH,蒸馏水和运行液各冲洗约5min。检测电极用超声波进行冲洗。更换运行液后也需按上述步骤清洗毛细管和电极。采用重力进样,高度差为20cm,时间为10s,方波安培检测器的输出信号经数据工作站采集到微机中进行实时数据处理,图形显示和数据

6、文件存储。实验在恒温(25,恒湿(70的实验条件下进行。2.结果与讨论2.1缓冲溶液的选择缓冲溶液由 -CD、柠檬酸、NaOH组成。柠檬酸+-CD体系是分离手性物质的常用体系,只要找到适当的pH值,就可以达到预期的分离效果。本实验使用电化学(电导/安培检测,实验证明可以取得良好的分离效果。2.1.1 -CD浓度的影响 -CD是手性选择剂,是对映体分离的主要因素,它的浓度直接决定了分离效果,不同浓度的-CD对两个对映体拆分的分离效果不同。高浓度和低浓度的-CD对手性拆分的机理也有变化2。高浓度的-CD 由于非特异性疏水作用和 -CD的二聚作用导致手性识别能力。低浓度的 -CD与两对映体的作用互相

7、竞争。 -CD的浓度也影响了底液的性质,使毛细管电泳的推动力电渗流产生变化,改变了对映体的分离性。实验也证明了这一点,图2-A是 -CD的时浓度为4mmol/L时的分离效果图,可以看出两个对映体还没有明显分开;图2-B是 -CD的时浓度为8mmol/L时的分离效果图,此时的分离效果比较满意;图2-C是-CD的时浓度为12mmol/L时的分离的效果图,此时的分离效果基本满意。当 -CD浓度大于8mmol/L小于12mmol/L时,去甲肾上腺素对映体分别得到完全分离。最佳 -CD浓度为8mmol/L .A B C4mmol/L8mmol/L12mmol/L图2 不同浓度的 -CD分离效果电泳条件:

8、柠檬酸8 mmol/L,NaOH 5 mmol/L,分离电压12.5KV,进样时间10S2.1.2柠檬酸浓度及pH值的影响在拆分过程中,通过选择pH值可以调整电迁移和电渗流的平衡,增加分离度。pH值不仅可以影响毛细管中的电渗流来改变出峰时间来改善分离效果,同时还会使手性对映体与-CD的相互作用变化,改变分析物的迁移行为和分离选择性。缓冲液pH值得选择还应兼顾迁移时间。在低pH情况下,电渗流很小,对于质子化程度较低的手性药物来说分析时间较长,提高pH值分析时间缩短3。所以在分辨率允许的范围内,常采用高的pH值。柠檬酸体系在方波安培检测中有良好的背景。本实验考察了电泳介质中柠檬酸的浓度分别为4-1

9、2mmol/L 时对映体的分离情况,实验结果表明:当柠檬酸浓度在4-8mmol/L时,去甲肾上腺素对映体得不到分离,如图3-A 所示,L型和R型在柠檬酸浓度为4mmol/L时得不到较好的分离效果。柠檬酸浓度大于8mmol/L后,对映体到达基线分离,但出峰时间较长,如图3-B所示,在柠檬酸浓度为8mmol/L时,去甲肾上腺素两对映体的分离效果较好,且出峰时间大约在12分钟左右;如图3-C所示柠檬酸浓度为12mmol/L时,分离效果很好,只是出峰的时间在13分钟左右。本实验选择柠檬酸浓度为8mmol/L。A B C4mmol/L8mmol/L12mmol/L图3不同浓度的柠檬酸分离效果图电泳条件:

10、 -CD 8 mmol/L,NaOH 5 mmol/L,分离电压12.5KV,进样时间10S2.2分离电压和检测电压的影响电压在拆分过程中有一最佳值。样品的出峰时间对电压的响应很敏感,高电压使溶液的电渗流值增加,从而加快了样品出峰时间。但是加大分离电压会产生较多的焦耳热而使温度升高,温度的升高又使溶液粘度变化,使毛细管壁上的溶液和毛细管中央的溶液的迁移速度不通,而造成峰形拖尾的现象。两对映体和 -CD 的包含是一个快速可逆的平衡过程,从热力学角度来讲,高温不利于包含,降低了 -CD 的分离效率2。同时高的分离电压下,毛细管会产生放电现象,致使采样数据的基线走不稳(特别是在湿度比较大的时候。图4

11、-A 是电压为12.5KV 时的分离效果,图4-B 是电压为10.5KV 时的分离效果。因为分离电压不是很高,所以理论上应出现的区带展宽和热效应引起的分离效果变差没有在下面两个图中展现出来。本实验选择分离电压为12.5KV 。调整方波安培的检测电压可以获得最佳响应信号,本实验选用检测电压为+0.80V (vs.Ag/AgCl 。+12.5KV +10.5KV 图4不同分离的电压分离效果图电泳条件: -CD 8 mmol/L ,柠檬酸8 mmol/L ,NaOH 5 mmol/L ,分离电压12.5KV ,进样时间10S2.3 旋光性测定 对于外消旋体,由于左、右旋体的量相等结果其旋光度为零,在

12、电泳图谱上表现为两个面积几近相同的电泳峰。本实验中去甲肾上腺素针剂样品的两个对映体的峰面积大小相差较大(见图5,表明其以非外消旋体形式存在,应具旋光性。将甲肾上腺素加水稀释成1mL 含2mg 的溶液,在钠光谱(539.3nm,20条件下,测得的旋光度为-0.565°。表明出峰较早的电泳峰对应的是左旋(-对映体,随后的右旋体(+。图5 去甲肾上腺素对映体分析电泳条件: -CD 8 mmol/L ,柠檬酸8 mmol/L ,NaOH 5 mmol/L ,分离电压12.5KV ,进样时间10S2.4重现性测定 在优化实验条件下,分别将20mg/L 去甲肾上腺素各连续6次测定,峰面积,如表1

13、所示。表1 重现性测定A B(-(+ 2.5 结论采用毛细管电泳/电化学检测方法分离检测去甲肾上腺素对映体可获满意结果,随着电化学分析检测技术的不断发展和研究的深入,其在手性药物对映体的分离检测中的优点将愈来愈为人们所认识,在手性CE中发挥应有的作用和作出应有的贡献。参考文献1 苑可戴立信,关注“手性药物”,科技术语研究,2002,4(2:22 朱晓峰薛俊林炳承,手性药物的毛细管电泳拆分环糊精系统,分析试验室,1996,15(3:13 朱涛方晓红孙亦梁,高效毛细管电泳.分析化学中的一个新的前沿领域,化学进展,1994,6(3:2344 谢天尧李娜唐亚军等,毛细管电泳方波安培检测法研究,高等学校

14、化学学报,2003,24(3:410致谢衷心感谢化学院创新实验基金和国家自然基金的资助,感谢唐亚军在实验中给予的帮助以及有益的讨论!Enantioseparation of Noradrenaline by Capillary Electrophoresis withElectrochemical DetectionXu Di-ming Xie Tian-yao(Department of Chmistry, Zhongshan University,Guangzhou. 510275,China Abstract:A New method of enantionseparation of noradrenaline by high performance capillary electrophoresis with electrochemical detection was developed.The enantiomer of noradrenaline was sperareted under the following conditions: 5mmol/L NaOH + 8mmol/L Citric acid + 8 mmol/L -CD as background electrolyte, +12.5KV operati