专业实验III临床生化检验

1、分光光度法测量【理论依据】朗伯一比耳定律：当溶液中的物质在光的照射和激发下，产生了对光吸收的效应。但物质对光的吸收是有选择性的，各种不同的物质都有其各自的吸收光谱。所以根据定律，当一束单色光通过一定浓度范围的稀有色溶液时，溶液对光的吸收程度A与溶液的浓度c （g/l）或液层厚度b（ cm）成正比。其定律表达式 A=abc （ a是比例系数）。当c的单 位为mol/l时，比例系数用&表示，则 A= e bc称为摩尔吸光系数。其单位为L/ （mol*cm ）。它是有色物质在一定波长下的特征常数。分光光度计性能检查 波长检查：根据溴甲酚绿在610nm有最大吸收峰，检测 722分光光度计的波长

2、测定是否准确。方法：580nm630nm，每5nm测定一次溴甲酚绿（BCG ）的吸光度，记录数据。 线性检查：根据朗伯比尔定律， 溶液吸光度与溶液的浓度成正比。 用一种有色物质配成不同浓度，在一定波长及一定浓度范围内确知其服从比尔定律，检查仪器本身是否能够如实的反映有色物质的浓度变化。一、双缩脲法测定血清总蛋白【原理】：血清中蛋白质的肽键在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色化合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜离子形成紫红色的反映相似， 故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，其吸光度与血清蛋白含量在一定范围内成正比，经与同样处理的蛋白

3、质标准液比较，即可求得蛋白质含量。双缩脲试剂中，酒石酸钾钠的作用：结合Cu2+，防止其在碱性条件下形成CuO沉淀。KI的作用：防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu2O的离析。【参考范围】健康成人：走动后为6483g/L，静卧时为6078g/L【临床意义】浓度增高见于：血浆浓缩（如急性脱水、外伤性休克、慢性肾上腺皮质功能减退）、蛋白质合成增加（如多发性骨髓瘤）浓度减低见于：血浆稀释（静注过多低渗溶液、水钠潴留）、营养不良或消耗增加（长期低蛋白饮食或慢性肠道疾病；长期患消耗性疾病）、蛋白质合成障碍（肝功能严重受损、此事宜清蛋白减低最为显著）、蛋白质丢失（严重烧伤、大出血、肾病综合征、溃疡性结肠炎）。

4、【注意事项】1 黄疸血清、严重溶血、葡聚糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有较大干扰，可以用标本空白管 来消除。2. 高脂血症患者的混浊血清会干扰比色测定。3本法也可用于血清总蛋白浓度的标化。【评价】优点：本法为测定血清总蛋白的常规推荐方法。重复性较好，干扰较少，操作简便、快速，用单一的稳定试剂，既适于手工操作，也便于自动化分析。缺点：灵敏度较低，比酚试剂法约低100倍。但本法的检出限为 0.2 g/L1.7g/L ,相当于70g/L 的血清3卩l24卩I,已能满足临床生化检验的需要。二、溴甲酚绿法测定血清清蛋白【原理】：溴甲酚绿（BCG ）在pH4.2的环境中，在有非离子去污剂存在时，可与清蛋白（Al

5、b ）结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色深浅在一定范围内与清蛋白含量呈正比，与同样处理的清蛋白标准液比较，可求得血清中清蛋白的含量。非离子去垢剂（Brij-35 ）的作用：提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性。【参考范围】成人为 3555 g/L , A/G=1.21.5（V 1.0称为A/G比例倒置）【临床意义】清蛋白的主要功能是调节血液的胶体渗透压。V28g/L临床上出现水肿。浓度增高见于：严重脱水导致的血浆浓缩浓度降低见于：Alb合成不足/障碍（肝脏疾病，尤其是肝功能严重损害）、Alb的分布异常（门静脉高压）、蛋白质丢失（大出血、烧伤）、Alb摄入不足或

6、消耗增加（见于营养不良、肠道肿瘤、肝功能受损、肾病蛋白尿、结核病伴慢性出血、恶性肿瘤等）。无清蛋白血症（analbuminaemia），极少见，患者血清中几乎无Alb【注意事项】1. BCG是一种pH指示剂，变色域为 pH3.8 （黄色）5.4 （蓝色），必须严格控制反应液的 pH , pH升高可使染料空白升高，与清蛋白结合率下降。2. BCG与蛋白结合的特异性较低，不但与清蛋白呈色，而且还可与其他蛋白质呈色，其中a 1-球蛋白、TRF、Hp最明显，但反应速度不同，清蛋白可立即反应（快反应） ，其他蛋白 质反应慢（慢反应）。由于血清与BCG试剂一经混合“慢反应”即可发生，约持续 1h完成, 故

7、有试剂要求在1min内测定吸光度，排除“慢反应”干扰。3. BCG试剂也可用其他缓冲液如枸橼酸盐或乳酸盐缓冲液。琥珀酸盐缓冲液的校正曲线通 过原点，线性好，灵敏度高，为首选推荐配方。4. 叠氮钠有防腐作用。Brij-35可提高蛋白质与染料的结合力及溶解度，提高呈色稳定性，可用其他表面活性剂代替（如吐温-20或吐温-80 ,终浓度为2ml/L ）,灵敏度和线性范围不变。5严重高脂血症，需做标本空白管（血清 0.02ml，琥珀酸缓冲贮存液 4.0ml）,用琥珀酸缓 冲贮存液调零，测定标本空白管吸光度，用测定管吸光度减去标本空白管吸光度， 计算结果。【评价】BCG法灵敏度高、操作简便、重复性好，既可

8、用作手工操作也可自动分析。是目前国内测 定清蛋白最常用的方法。但该法存在问题较多，主要是试剂标准化、标准品的选用、反应时间等，如不严格掌握，将会对测定结果造成严重影响。尤其要注意反应时间和反应体系的酸碱度。Vc< 0.4g/L、血红蛋白w 4g/L对测定无影响。本法线性范围为10 g/L60g/L。相关：质控图绘制【原理】：质控图是一种具有质控界限的图形。以质控品测定结果计算均值和标准差（S）,以土 2S为警告线，以土 3S为失控线绘制质控图。正常分布：正常分布2、正常分布规律:95%数据落在土 2s内；不能有连续5次结果在同一侧；不能有5次结果渐升或渐降； 不能连 续 2 个点落在&#

9、177; 2s 以外；不应该有落在± 3s 以外的点。3、常见异常图形：（1）漂移： 有连续 5 次结果在同一侧，提示存在系统误差。（2）趋势性变化： 有 5 次结果渐升或渐降，说明试剂或仪器的性能已发生变化。（3）精密度变化： 二个质控结果之差超出 4S 范围，提示测定的偶然误差较大，如仪器、 试剂不稳定等。【注意事项】1. 控制物的种类及其使用。2. 更换质控品。3. 稳定性较长的质控品靶值、控制限设定。4. 稳定性较短的质控品靶值、控制限设定。5. 特殊情况的处理（ Grubbs 氏法）。6. 失控后的处理。一、乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯【原理】：血清甘油三酯（TG）经正庚

10、烷-异丙醇抽提，然后用氢氧化钾皂化，所生成的甘 油再被过碘酸钠氧化成甲醛， 后者在铵离子存在下与乙酰丙酮反应， 生成带荧光的黄色物质 即 3， 5-二乙酰 -1， 4-二氢二甲基吡啶，颜色深浅与血清甘油三酯浓度成正比。与同样处理 的标准液比较，求得其含量。 抽提：正庚烷-异丙醇-稀H2SO4 皂化： KOH- 异丙醇使 TG 水解生成甘油 氧化：甘油 +过碘酸钠（酸性 pH） t甲酸+甲醛 显色：甲醛+乙酰丙酮 （NH4+ ） t 3, 5-二乙酰-1, 4-二氢二甲基吡啶【理想范围】v 1.7mmol/L【临床意义】TG 升高：可见于家族性高 TG 血症、家族性混合性高脂血症、冠心病、 AS

11、 、糖尿病、肾病 综合征、 甲状腺功能减退、 胆道栓塞、 糖原累积症、 妊娠、 口服避孕药、 酗酒、急性胰腺炎。 高 TG 也是冠心病的独立危险因素。临床中大部分血清 TG 升高见于代谢综合征。TG降低：见于COPD、脑梗死、甲亢、甲旁亢进、营养不良、吸收不良综合征、先天性a-B脂蛋白血症等。还可见于过度饥饿、运动等。【注意事项】1 吸取上层液时要注意，不可吸到下层，否则易浑浊。2血清 TG 易受饮食的影响。3加样后要立即比色 4本方法所用试剂较稳定，室温下可保存半年，分装使用可避免因试剂污染而引起的空白 值升高。5每一批测定都应该同时做标准对照。6 超出此线性范围或血清明显混浊，可用生理盐水

12、作倍比稀释后再测。7. 以血浆作标本时，应注意抗凝剂的影响。通常使用EDTA K2 （1mg/ml ）作抗凝剂。8取血后应及时分离血清（或血浆） 。【评价】本法测定范围较宽，在 0.28mmol/L12.93 mmol/L之间具有良好的线性关系，回收率为 100.4%117.3%，批内变异系数为 2.49%，批间变异系数为2.18%，能满足临床检验方法学 的要求。 过碘酸氧化甘油生成甲醛的反应是非特异的， 血清中磷脂、 葡萄糖、 游离甘油等也会被非特 异地氧化。本实验方法中采用了分溶抽提， TG 分配在正庚烷相中， 而磷脂等则分配在异丙醇 -水相中， 提高了反应的特异性。二、测定血清总胆固醇

13、【原理】：血清脂类包括甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯、磷脂、糖脂、游离脂肪酸。它们在 血液中以脂蛋白 （脂和载脂蛋白的复合体） 的形式存在。 用超速离心技术可把血浆脂蛋白分 成四大族：CM、VLDL、LDL、HDL，用电泳技术可把血浆脂蛋白分成a-脂蛋白、前B -脂蛋白、B -脂蛋白、CM。血清中总胆固醇（TC）包括游离胆固醇 FC和胆固醇酯（CE）两部分。胆固醇酯可被胆固 醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA），胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成 4-胆甾烯酮和过氧化氢，H2O2在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中 TC 含量成正比。

14、胆固醇酯+ H2O （胆固醇酯酶）t胆固醇+脂肪酸胆固醇+ O2 （胆固醇氧化酶）t 4-胆甾烯酮 + H2O2H2O2 + 4-氨基安替比林（过氧化物酶） t 醌亚胺 + H2O【理想范围】v 5.2mmol/L。升高： 5.72mmol/L【临床意义】人群中约 10%的缺血性心血管病发作可归因于血清 TC 升高TC 升高：见于各种高脂蛋白血症、梗阻性黄疸、肾病综合征、甲状腺功能低下、慢性肾衰、 糖尿病等。此外，吸烟、饮酒、紧张、血液浓缩等也可使 TC 增高。妊娠末三个月时也可能 明显升高，产后恢复原有水平TC 下降：见于各种脂蛋白缺陷状态、肝硬化、恶性肿瘤、营养不良、巨幼贫等，此外，女 性

15、月经期也可降低。三、离子选择电极法测定血清钾、钠、氯【原理】： ISE 电位法是以测定电池的电位为基础的定量分析方法。 将 ISE 和一个由 Ag-AgCl 构成的参比电极连接， 置于待测的电解质溶液中， 形成一个测量电池。 此电池的电位随样品 的粒子活度的改变而改变，电位的变化符合能斯特（Nernst）方程。钾、钠、氯、离子电极属于ISE，其电极电位的变化分别与钾、钠、氯离子活度成比例。【参考范围 & 临床意义】1、血清钠： 136145mmol/L增高见于：肾上腺皮质功能亢进、严重脱水 降低见于：胃肠道失钠、尿钠排出增多、皮肤失钠、抗利尿激素过多。2、血清钾： 3.55.2mmol

16、/L增高见于：肾上腺皮质功能减退、急性 /慢性肾衰、休克、组织挤压伤、重度溶血、口服 /注 射含钾溶液过多 降低见于：严重腹泻、呕吐、肾上腺皮质功能亢进、服用利尿剂、使用胰岛素、钡盐/棉籽油中毒3、血清氯： 96108mmol/L升高见于：急性/慢性肾小球肾炎，有氯潴留；碳酸氢盐丧失，血清氯增高，导致高氯 性酸中毒；输入含氯量高的药物，如盐酸精氨酸，大量服用氯化铵降低见于： 频繁呕吐和胃肠道减压、 急性肾功能不全、肾上腺皮质功能亢进、慢性呼吸功能 不全、心功能不全、肝硬化腹水等。【注意事项】1电解质分析仪一般 24h处于开机状态。2所有的样品应在室温下保存，不要冷冻，盛血样的容器必须干净。样品

17、采集后尽快地测 量，最好不超过1h，否则样品pH值会发生变化。3在样品测量时，注意样品管道内的样品不能有气泡存在。4尿样检测时，应先离心尿样，以去除细胞、晶体等。然后将尿样作10倍稀释后测定，不得分析未经稀释的尿样。5应严格按时进行仪器的日常维护和保养。6仪器安装平稳，避免震动，避免阳光直射以及潮湿。-、血清钙测定【血钙、可扩散钙、不可扩散钙的关系】f离子钙（游离钙（约50%）r与柠檬酸等结合（小部分）可扩散钙%结合钙（约50%乂与瘠蚩白结合（大部分不可扩散钙【原理】：血钙+邻甲酚酞络合铜（OCPC）（pH=11.0 ） T 紫红色络合物，这种紫红色络合物在 575nm处有最大吸收峰，其吸光度

18、与血清钙含量在一定范围内成正比， 经与同样处理的钙标准液比较，即可求得血清钙含量。【参考范围】：成人为1.101.34mmol/L，儿童大约比成人高 0.05mmol/L【临床意义】：增高常见于：原发甲亢、恶性肿瘤、维生素D中毒、肾上腺皮质功能降低、骨髓增殖性疾病降低常见于：甲减、慢性肾衰、急性胰腺炎等二、血清磷测定【原理】：无机磷+钼酸铵 （H+）- 磷钼酸【参考范围】：0.962.10mmol/L【临床意义】血磷受饮食摄入磷的影响较明显，当摄人磷不足时，机体不会像缺钙那样立即动员骨磷人血,而是先出现血磷降低。血清无机磷升高：除见于维生素D中毒（血钙、血磷均升高）和甲旁减外，以肾滤过磷障碍（

19、如肾衰竭）为常见。另外，也见于多发性骨髓瘤、糖尿病酮症酸中毒治疗前、乳酸性酸 中毒、骨折愈合期、肢端肥大症和巨人症等。血磷降低见于：维生素 D缺乏、高胰岛素血症、儿童型侏儒症、脂肪泻、甲旁亢和输注大 量葡萄糖液后等。三、血清铁、总铁结合力测定【原理】：血清中的三价铁与运铁蛋白结合成复合物， 在酸性介质中铁从复合物中解离出来， 再被还原 剂还原呈二价铁，与亚铁嗪直接作用生成紫红色复合物，在 562nm 处有吸收峰，与同样处 理的铁标准液比较，可求得血清铁含量。总铁结合力 （TIBC ）：是指血清中运铁蛋白全部被铁饱和所能结合的铁量。 将过量铁标标准 液加到血清中， 使之与未结合的运铁蛋白结合，

20、多余的铁被碳酸镁粉吸附除去， 然后测定血 清中总铁含量，即为总铁结合力。为了防止外来铁的污染，实验用水必须经过去离子处理。玻璃器材必须用10%（体积比）的盐酸浸泡 24h ，取出后再用去离子水冲洗，方可运用。【参考范围】：血清铁：成年男性1130卩mol/L，成年女性927卩mol/L。血清总铁结合力： 成年男性 5077卩mol/L，成年女性 5477卩mol/L。【临床意义】 血清铁： 增高见于红细胞破坏过多 （如溶血性贫血） 、红细胞的再生或成熟障碍（如再障、 巨幼贫）。减低见于缺铁性贫血、慢性长期失血、恶性肿瘤等。 血清总铁结合力：增高见于缺铁性贫血、急性肝炎等。减低见于肝硬化、肾病、

21、尿毒症和 血色素沉着症等。【注意事项】1. 实验用水必须经过去离子处理。玻璃器材必须用10% （V/V ）盐酸浸泡24h，取出后再 用去离子水冲洗后方可应用。应避免与铁器接触，以防止污染。2. 溶血标本对测定有影响，因此血清应避免溶血。3标准液呈色可稳定24h。血清呈色在 30min内稳定，此后颜色会慢慢增加，大约每小时吸光度增加 0.002，因此，应在 1h 内比色完毕。4. 血清铁存在着日内生理性变异，早上含量最高，晚上含量最低。【评价】1 .血清铁的测定方法有多种，比色法仍然是测定血清铁的主要方法。2. 比色法中，由于显色剂的不同而有多种方法。目前常用的显色剂主要有铬天青、亚铁嗪、 2-

22、（5-溴-2-吡啶偶氮） -5-二乙氨基酚（ 5-Br-PADAP ）、菲罗啉等。3. 171mol/L以下胆红素对比色法测定血清铁干扰不大；甘油三酯在3.39mmol/L以下基本无干扰， 3.73mmol/L 仅增高 0.94%， 5.56mmol/L 增高 5.6%；在生理条件下铜与铜蓝蛋白 结合，故对铁的测定基本上无干扰。家兔糖耐量（ OGTT ）试验口服葡萄糖耐量试验是一种葡萄糖负荷试验， 用以了解胰岛B细胞功能和机体对血糖的调节 能力，是诊断糖尿病的确诊试验， 广泛应用于临床实践中， 对于处于其他疾病急性期的患者， 可能需要重复进行以明确糖尿病的诊断。【葡萄糖耐量试验】 ：是检查人体

23、血糖调节机能的一种方法。正常人在服用一定量葡萄糖后 血糖浓度暂时升高，但在两小时内血糖浓度又恢复到空腹水平，称为“耐糖现象”。在服用一定葡萄糖后间隔一定时间测定血糖和尿糖， 观察血糖水平以及有无尿糖出现， 称为糖耐量 试验。若因内分泌失调等因素引起葡萄糖代谢失常时，食入大量糖后血糖浓度可急剧升高， 或升高极不明显， 短时间内不能恢复原值者即为耐糖现象异常， 临床常对症状不明显的患者 用糖耐量试验来诊断有无糖代谢异常。【原理】葡萄糖+O2+H2O （GOD葡萄糖酸内酯+H2O2H2O2+4-氨基安替比林（POD） t 红色醌类化合物 （此即Trinder反应）【注意事项】这是针对于人的 OGTT

24、 试验试验前每天碳水化合物摄入量不少于150克，有正常的体力活动至少3 天。 过夜空腹10 16个小时。 试验前 8 小时禁止吸烟、饮酒或咖啡，口渴可以饮水。 被试者应尽 量注意休息，不做剧烈的体力活动， 避免精神紧张，保持情绪稳定。 将 75 克葡萄糖溶于 300 毫升温开水中（或每千克体重口服 1.75 克葡萄糖，每克糖溶与 2.5 毫升水中），令受检 者一次服下， 5 分钟内饮毕。 分别于服糖前及服糖后0.5、1、2、3 小时各采取静脉血一次，并同时收集尿液标本，测定血糖、尿糖和胰岛素及 C 肽的数值。【参考范围】空腹3.9-6.1mmol/L , 1小时血糖上升至高峰v11.1mmol

25、/L, 2小时下降v7.8mmol/L ， 3小时下降至空腹血糖。【结果判断】：正常为给糖后1 /21小时血糖浓度迅速上升，2小时后恢复至空腹水平，如果服糖后 2 小时未降至正常水平，且尿糖阳性，即为糖耐量减低。【临床意义】 ：确诊糖尿病。了解血糖波动范围，分析糖尿病稳定程度。糖尿病患者空腹血糖与餐后3小时血糖值差距越小越稳定，反之则越不稳定。赖式法测定血清丙氨酸氨基转移酶【原理】：丙氨酸氨基转移酶（ALT ）催化L-丙氨酸与a -酮戊二酸间的氨基移换反应，生 成a -丙酮酸和L-谷氨酸。经30min反应后，加入 2, 4-二硝基苯肼终止反应，并与反应液 中的两种a -酮酸生成相应的2, 4-

26、二硝基苯腙（丙酮酸苯腙和a-酮戊二酸苯腙）。在碱性条件下，两种苯腙的吸收光谱曲线有差别，在 500520nm 处差异最大，以等摩尔浓度计算， 丙酮酸苯腙的呈色强度约为a-酮戊二酸苯腙的3倍。据此可以计算丙酮酸的生成量。L-丙氨酸+ a -酮戊二酸（ALT ） t a -丙酮酸+ L-谷氨酸a -酮酸+ 2, 4二硝基苯肼（碱性条件2, 4-二硝基苯腙（红棕色，505nm）【参考范围】 525 卡门单位【临床意义】 ALT 在肝细胞中含量量较多 ,且主要存在于肝细胞的可溶性部分。一、当肝脏受损时,此酶可释放入血,致血中该酶活性浓度增加。 ALT是肝细胞损伤的灵敏指标。急性病毒性肝炎时，转氨酶阳性

27、率为80%100% ;肝炎恢复期转氨酶正常。但如在 100U 左右波动或再度上升为慢性活动性肝炎。整整肝炎或急性 坏死性肝炎时, 再度上升的转氨酶在症状恶化的同时, 酶活性反而降低, 提示肝细胞坏死后 增生不良。预后不佳。 慢性活动性肝炎或脂肪肝时，转氨酶轻度增高（100200U ）,或在正常范围，且 AST >ALT 。肝硬化、肝癌时， ALT 有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后很差。其 他原因引起 的肝脏损害。如心功能不全时,肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死,可使 ALT、AST 明显升高;某些化学药物如异烟肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂 等可不同程度地损害肝细胞,引起 ALT 的升高 其他可引起 ALT 不同程度增高的疾病或因素：骨骼肌损伤、多发性肌炎等二、ALT 活性降低见于：磷酸吡哆醛缺乏症。【注意事项】 1宜用血清标本测定。草酸盐、肝素、枸橼酸盐虽不抑制酶活性,但可引起反应液的轻度 混浊。红细胞内 ALT 为血清中 3 倍 5 倍,应避免溶血。2当血清标本酶活力超过 1 50卡门单位时, 应将血清用生理盐水稀释 5倍或 10倍后再进行 测定。3. 血清中ALT在室温（25C）可以保存 2d,在4C冰箱可保存1周，在-25 C可保存1个 月。一般血清标本中内源性酮酸含量很少, 血清对照管吸光度接近于试剂空白管 （以蒸馏水代替