本标准等同采用美国公职分析化学师协会(AOAC)方法,测定的是具有生物

1、GB/T 5413.251997前言本标准等同采用美国公职分析化学师协会（AOAC）方法，测定的是具有生物效价的肌醇含量。本系列标准从实施之日起，代替 GB 54131985。 本标准由中国轻工总会提出。 本标准由全国乳品标准化中心归口。 本标准负责起草单位：国家乳制品质量监督检验中心。本标准参加起草单位：卫生部食品卫生监督检验所、浙江省轻工业研究所、 哈尔滨森永乳品有限公司、雀巢（中国）投资服务有限公司。 本标准主要起草人：张玉杰、王芸、房玉国、王克新。中华人民共和国国家标准婴幼儿配方食品和乳粉 肌醇的测定Milk powder and formula foods for infant an

2、d young children-Determination of inostitolGB/T 5413.2519971范围本标准规定了肌醇的测定方法。 本标准方法一适用于婴幼儿配方食品和乳粉中肌醇的测定，方法二适于乳粉中肌醇的测定。方法一微生物法2方法原理通过 Saccharomyces uvarum 的生长情况来评价肌醇的含量。3试剂、菌种和培养基 所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。31盐酸：体积比为 1：1将体积分数为 37%的浓盐酸 50mL 用水稀释至 100mL。32氢氧化钠：c(NaOH)为 1mol/L将 40g 氢氧化钠溶解于水中

3、，稀释至 1000mL。33肌醇标样：无水晶体。34菌种国家技术监督局 19970528 批准19980901 实施GB/T 5413.251997Saccharomyces uvarum。35培养基351链孢霉菌琼脂培养基：3 号蛋白胨 5g，酵母浸膏 5g，麦芽糖 40g，琼 脂 15g。352肌醇测定用培养基：葡萄糖 100g，柠檬酸钾 10g，柠檬酸 2g，磷酸二 氢钾 1.1g，氯化钾 0.85g，硫酸镁 0.25g，氯化钙 0.25g，硫酸猛 50mg，氯化亚铁 50mg，DL-色氨酸 800mg，L-胱氨酸 0.1g，L-异亮氨酸 0.5g，L-赖氨酸 0.5g，L-蛋氨酸 0.

4、2g，DL-苯基丙氨酸 0.2g，L-酪氨酸 0.2g，L-天门冬酰胺 0.8g，DL- 天门冬氨酸 0.2g，DL-丝氨酸 0.1g，甘氨酸 0.2g，DL-苏氨酸 0.4g，L-缬氨酸0.5g，L-组氨酸 0.124g，L-脯氨酸 0.2g，DL-丙氨酸 0.4g，L-谷氨酸 0.6g，L- 精氨酸 0.48g，盐酸硫胺素 500g，生物素 16g，泛酸钙 5mg，盐酸吡哆醇 1mg， 加蒸馏水至 1000mL，pH5.2±0.2（25）。4仪器 常用实验室仪器及：41pH 计。42250mL 圆底烧瓶，与冷凝器连接的锥形玻璃接头。43比色仪。5样品制备51贮备菌种的制备511从

5、纯菌种 S.uvarum 中转接 2 个以上已制备好的麦芽浸出汁琼脂斜面。30培养 1624h。贮于冰箱中，保存期不要超过 2 周，然后再转接到新的琼脂 斜面上。512接种的准备 最好在使用的当天从贮备菌种中转接到新配制的麦芽浸出汁琼脂斜面上，30培养 1624h。用接种环无菌地转接该菌种到一个灭菌生理盐水中，直到得到 一定浓度菌体细胞的悬浮液。为了测定，制备一个酵母菌悬浮水溶液，这个悬浮 液中酵母菌的浓度在 0.1mg/mL。分光光度计事先用水调到 100%透光率，然后测 定这个“标准”酵母菌的透光率。将新接种斜面中的菌体细胞移入到无菌生理盐 水中，其浓度直到达到与上述标准溶液具有相同的透光

6、率为止。52标准溶液521标准贮备液，肌醇的浓度为 0.2mg/mL。称取 100mg 肌醇（该肌醇标样已放在干燥器中干燥 24h），于容量瓶中用水 稀释至 500mL。贮于冰箱。522标准工作液，肌醇的浓度为 2µg/mL。吸取 5mL（5.2.1）溶液，用水稀至 500mL，定容。当天制备。6操作步骤61样品的处理611干粉样品精确称取一定量样品，这些样品中约含肌醇 0.5mg，移入 250mL 圆底烧瓶中， 加 100mL 盐酸（1：1）（3.1），继续 6.1.3 步骤。612液体样品。吸一定量样品，这些样品中约含肌醇 0.5mg，加 100mL 盐酸（3.1），继续 6.1

7、.3 步骤。613将装样品的圆底烧杯与冷凝器联结，经过 6h，通过蒸馏将盐酸除去。国家技术监督局 19970528 批准19980901 实施GB/T 5413.251997将剩余物用蒸馏水冲到烧杯中，用 1mol/L 氢氧化钠将溶液的 pH 值调至 5.1±0.1。稀释至 250mL，过滤，弃去前部几毫升。这个溶液肌醇的浓度均为 2g/mL。62标准曲线按表 1 顺序加入蒸馏水、标准溶液于培养管中，一式三份。 表1 试管号 No.1234567蒸馏水，mL5543240标准溶液，mL001234563测定液按表 2 顺序加入蒸馏水、样品溶液于培养管中，一式三份。 表2 试管号 No

8、.1234蒸馏水，mL4321标准溶液，mL123464热处理用棉塞或不锈钢帽盖住所有试管，100蒸汽蒸 10min。65接种冷却试管至 30以下。无菌添加接种物于基础贮备培养基中，以每 100mL 添加 2mL 的比例添加，充分混合，将上述已接种的培养基无菌加入到 6.2 和 6.3 的每个测定管中，每管加 5mL（其中标准曲线中 No.1 号试管只加 5mL 接种的培 养基）。66培养将试管固定在机械振荡器上，以每分钟振荡 100200 次的往复运动中，2830之间选择一个恒定温度（±0.5）培养 2224h。67测定从振荡器上取下试管，于 100蒸 5min 或每管加 1 滴杀

9、菌剂（Thoral），以 使其停止生长。试管被任何外来微生物污染则测定无效。通过对每个试管的视觉检查进行反 应的预测，未接种管是清的，标准溶液和样品中应无其他微生物生长。充分混合每一个试管（也可以加一滴消泡剂），将反应液加到比色皿内，搅 拌内容物，将比色皿放入到分光光度计的比色池内，波长为 540660nm，读出 透光率或吸光度，稳定 30s，每个试管稳定时间要相同。对于未接种管，将其透光率调到 100%（或吸光度为 0），读出其他接种空白 管的读数。将接种空白管的透光率调到 100%（或吸光度为 0），依次读出其他每个管。 对每个水平的测试溶液，计算每毫升中维生素的含量，计算所得值的平均数，

10、 每个管测得值不得超过该平均值的±15%。如果所得到的管数，少于所测定的四 种水平的稀释液的管数的 2/3，用于计算样品浓度的数据是不充分的。如果剩余管数是原来管数的 2/3 或更多，则可根据平均值计算其样品的含量。 注：不可使用金属帽（除了不锈钢盖），这是由于试管在培养振荡过程中有金属污染的可能性。7分析结果的表述样品中肌醇的含量（mg/100g 或 mg/100mL）= X × 250 ×100 （1）m1000国家技术监督局 19970528 批准19980901 实施GB/T 5413.251997式中：X测定管中每毫升测试溶液中肌醇含量的平均值，

11、1;g；m样品的质量或体积，g 或 mL8允许差方法二气相色谱法9方法提要样品中的肌醇与衍生剂反应后，经气相色谱时行分离定量。10试剂101N-三甲基硅基咪唑。102三甲基氯硅烷。11仪器111气相色谱仪：FID 检测器。112色谱柱：50%Phenylmethylcloxane，Cb-17（J&w）。0.32mm id×30m0.25µm。12操作步骤121准确称取 1g 样品于烧杯中，用温水溶解，转至 100mL 容量瓶中，定容。 取 5.0mL 该溶液放入小试管中作为测定液。122准确称取 50mg 肌醇标样于烧杯中，用水溶解，转至 100mL 容量瓶中，定 容。用吸量管取该溶液 5mL 于一 100mL 容量瓶中，用水定容。取此溶液 2mL 于小 试管中。123将上述分别含有样品和标准溶液的试管冷冻干燥。于每个试管中加 1mL 内标溶液（每毫升吡啶中含 0.05mg 的蒽），盖紧塞子， 放置 15min。于每个试管中加 0.5mL 的 N-三甲基硅基咪唑和 0.2mol/L 的，混合，静置15min 后进样。124气相色谱条件： a）柱温：140260（5/min）； b）检测器：FID； c）检测器温度：280； d）进样器：split（1：40）； e）进样体积：1L； f）流速：1.4mL/min。13分析结果的表述样品中