实验三 酵母核糖核酸的提取及测定

1、实验三 酵母核糖核酸的提取及测定一.研究背景及目的核苷酸类物质及其衍生物是遗传工程、医药、食品、农业生产和科研领域十分重要的生化试剂和原料 。其功能有：领域物质作用医药腺苷酸及其衍生物扩张血管和降压作用尿苷酸及其衍生物葡萄糖醛酸酐的生物合成，脑磷脂代谢鸟苷酸及其衍生物高效光谱抗病毒药胞苷酸及其衍生物抑制DNA合成、治疗病毒病食品保健调味品呈味核酸奶粉抗细菌感染保健品延长寿命、增强免疫力、降血压、血脂农业植物生产生长刺激剂目前我国由核酸生产的核苷酸类产品的年产量不足 100t ,不仅不能满足国内市场需要 ,而且每年还需从国外进口270t ,耗费外汇 10 亿美元左右 。我国是个农业大国 ,人 口

2、众多 ,就核苷酸应用于农业、食品方面来说 ,核苷酸市场潜力很大 。现有可耕地面积 14 亿多亩近 2/ 3 的中低产地 , 与发达 国家相比,农作物单产还较低 。若按全国 10 亿亩耕地全部 使用核苷酸配剂 ,每亩用量 20g 计 ,这 10 亿亩耕每年使用核苷酸可达 2 万多t2 。 本次实验是食品医药卫生领域大工业生产RNA制剂的具体设计。二.原理 微生物是工业上大量生产核酸的主要原料。采取酵母因为核酸的提取不需要很高活性的菌体，酵母是啤酒厂废弃的原料，从经济角度讲，用来提取核糖核酸最为理想。 提取RNA的方法很多，常见的有如下几种：（本次实验采取浓盐法10% NaCl）方法原料特点稀碱法

3、碱溶细胞壁，释放RNA浓盐法加热，高盐改变细胞膜透性注意温度：在90-100浸提苯酚法，氯仿-异戊醇法RNA溶于上层酚饱和的水相，DNA和蛋白质留在酚层可得到天然状态下的RNA分子 核酸是由糖、碱基、磷酸以一定比例构成的，理论上定量核酸只需测定其中一种即可。定磷法准确、微量、快速，是最好的方法。紫外吸收法简单快速，但是当体系内有蛋白质及其他含共轭双键物质存在时干扰较大。 本次实验采用紫外吸收法。 基本的提取策略为：我们可以通过使用化学因素破坏细胞膜，使其中的核酸流出来，接着纯化、测定含量即可。其中影响我们纯度和定量的主要因素就是蛋白质及有共轭双键物质的干扰，所以，我们的主要目标就是排除蛋白质和

4、有共轭双键物质对含量测定的影响。尽量保持RNA的完整性有利于提取率。 对于RNA酶的干扰，工业生产的流水化作业，使得人员参与较少，而且工业生产并不像实验室对RNA的完整性要求那么高，所以工业生产中RNA酶的存在不是主要矛盾。三.仪器与试剂试剂：10%NaCl；6MHCl；95%乙醇（分析纯）；2%氨水；RNA沉淀剂仪器：722-分光光度计（上海分析仪器总厂）；微量可调手动移液器(大龙牌)；具塞试管（15ml）;漏斗（25ml一只，50ml两只）；研钵；匀浆器；低速离心机（飞鸽牌，TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）；药物天平（HCTP12B1，北京宣武天平厂制）；硫酸纸；烘箱（）四.实验步骤

5、按下表进行操作：步骤操作提取称7g酵母粉，干燥研钵中磨至面状粉末，移至三角瓶中，量取50ml10%NaCl，倒入三角瓶，使酵母粉完全彻底悬浮浸润（肉眼不可见块状物）。使三角瓶在沸水浴中浸提40min。分离上述液体使用冰浴冷却后（至少10min），转入离心管，3500r/min，30min，取上清液沉淀RNA上清液冰浴冷却至10，在冰水浴中小心搅拌，用6MHCl调节pH至2.0-2.5.(严格控制pH)随着pH下降，溶液中白色沉淀逐渐增多，pH调好后继续冰水浴中冰浴4h.洗涤纯化冰浴后的悬浮液轻柔而彻底地充分搅拌起来转入离心机。3500r/min，15min，弃去上清液，得RNA沉淀。直接在离心

6、管中用95%乙醇洗涤三次，每次15ml乙醇（于同一试管内），充分彻底悬浮搅拌洗涤，离心3000r/min，10min（洗三次，离三次）干燥取干燥后的硫酸纸（精确沉重）边缘叠起成框备用，将离心后的RNA沉淀均匀涂布于硫酸纸上，80烘箱内放置5min，使沉淀干燥。称硫酸纸和RNA制品总重，将大部分RNA移至玻璃匀浆器内，记录剩余物质的总重。含量测定（本次给定比消光系数0.022）上步中的匀浆器内加5ml蒸馏水，垂直搅拌至RNA胶体。将RNA胶体转至干净烧杯内，10ml左右蒸馏水分次清洗匀浆器，洗液并入小烧杯（总体积不得超过15ml）用2%氨水调至pH7.0后，转入25ml容量瓶中，洗涤定容取两个试

7、管，A中加RNA液，蒸馏水各5ml，B中加RNA液、固定液各5mlA,B管各自混匀后，冰浴20min，分别转入离心管，3500r/min，10min取上清液于另两只试管中，分别混合均匀后各取0.5ml至两50ml容量瓶中，定容紫外分光光度计上测定OD260（A为实验组，B为对照组）利用公式计算制品纯度和产率五.数据整理与结果计算I.干燥RNA样品含量：硫酸纸质量W1（g）硫酸纸+RNA样品质量W2（g）硫酸纸+残余RNA质量W3（g）0.58870.70030.5981II. OD260记录表:管B管A管OD2600.000.261OD2800.000.116OD260/ OD280=2.25

8、一般RNA的OD260/ OD280>2;DNA OD260/ OD280约为1.9；样品中有蛋白质含量较高时比值下降。因此，可推断，该体系为RNA且较纯。紫外法测定蛋白质含量校正数据OD280/ OD260的最小值为0.595.因此没有办法得到蛋白质的准确值。根据下公式得到制品纯度和产率：=57.9%=42.9%六.质疑:1.为什么采取紫外吸收法定量核酸.由于蛋白质含量较低时，对吸光度的影响不大，因为在260nm下，蛋白质的吸收值约为核酸的1/10.本次实验经过多次乙醇的洗涤，核酸的纯度已经达到一定的浓度，紫外法操作简便，因此可使用紫外法。2.测定W3之前需要烘干一下。这样测量的才是转

9、入匀浆器的样品量。3.为什么A不做多组平行管。因为没有意义，如果从稀释后的溶液中取出3只试管的待测液，相当于同一个待测测量3次；如果我们从定容那步开始做平行，也是相当于同一溶液测3次。追根溯源，如果想要做平行，就要从加热浓盐法破壁开始，实际上，如果想要测出这种方法所能达到的纯化程度，这样做是有意义的，如果作为学生实验，这么做意义并不大反而增加工作量。4.文献影响浓盐法提取啤酒酵母RNA的工艺参数研究中认为浓盐法破壁的原理是高盐使得酵母自身破裂放出RNA，这点我不敢苟同。浓盐法是改变细胞膜的透性，并没有使细胞裂解。5.有的组测量了以蒸馏水为空白对照组的OD260和OD280，结果发现管A,B之间

10、的吸光度不是简单的加和关系，这点让我很费解。可能的原因也没有猜到，难道是狼比尔定律在浓度很低（B管）时也不适用吗？总结： 抓主要矛盾！这是我这次实验后感受最深的一句话。举个例子在称量RNA制品重时，以下几个事件对重量的影响：被人碰了撒地上了>称量时一碰撒天平上>速度慢样品吸水 我这回称量完成后虽然想到了人太多，小心样品！但是没有重视，就真出事了。实验时一定要避免不必要的意外。我不犯人，但也要防止人犯我。在撒了样品后，我们从新收集了较为干净的样品，那个时候，应该再次烘干称量的，但是由于手忙脚乱的收集过后，不太清醒，直接就称量了。但是，我们在称量W3时又从新回去烘干的，这就导致了RNA

11、实际转入进匀浆器的要少，因此，导致我们算出的纯度有所下降。虽然洗了四次，而且产率开始很好，但是一次意外过后，都化作云烟了。这就告诫我，实验时要注意意外事件的发生。 参考文献1.中国农业大学.生物化实验室.生物化学实验指导 26-28页2.王定昌.核酸酵母产品的开发和应用J.粮油食品科技 第10卷 2002年 第4期3. 乔宾福. 实用微生物技术M.上海:上海科学技术文献出版社, 1994.思考题：1、 本实验为何选用酵母为生产原料？在分离纯化的实验选材上有哪些主要原则？选择酵母的原因：微生物繁殖快、代谢旺盛、体积小、培养成本低利于工业生产 啤酒酵母是啤酒厂的副产品，来源广、成本低，合理的处理酵

12、母也能防止对环境的污染微生物中酵母的RNA含量比较高（2.7-11%）3 酵母的生活规律为人熟知，用于生产、使用较为安全 。分离纯化 原则: 选材:材料中所含目标产物较多材料中的其他杂质易于除去 材料易得 2、浓盐法的选择是基于怎样的考虑？ 仅仅从RNA回收率和纯度上看，稀碱法略优于浓盐法，且时间短，反应温度低。但是稀碱法对酵母有选择，提取颜色较深，很难溶解，而且对设备要求较高，设备一次性投资较大，再加上管理和维护等原因，一般采用浓盐法。同时，流水线作业可以大幅度缩减时间，浓盐法慢些也是可以承受的。本次的实验就是实现工业生产核酸的过程，所以采用浓盐法。3、本方法为何选用等电点沉淀作为最主要的纯

13、化步骤？ RNA等电点和大多数蛋白质相差较大，因此决定我们有等电点沉淀的理论基础。实验室中为得到RNA的自然结构，会采取有机溶剂沉淀的方法，但工业生产的核苷酸多为食用、药用，有机溶剂不易除去，会造成安全隐患。同时有机溶剂较昂贵，通常可燃，也不适于工业生产中大量使用。4、DNA的去除本方法是怎样考虑的？ 本实验中，采取浓盐法改变细胞膜的透性，使得细胞质中的RNA流出来，但是并没有破坏到核膜的透性，因而大多数的DNA还留在细胞内。有可能有部分核膜被损坏，或是部分DNA夹在线粒体中流出来时，实验主要利用DNA等电点和RNA差别较大的特点除去这部分DNA（RNA等电点在2.0-2.5，而DNA由于蛋白

14、质修饰等原因等电点在4.0-4.5）所以在我们调等电点沉淀RNA时，DNA就留在了溶液中而被除去了。同时DNA在10%的NaCl溶液中溶解度较小，大部分以沉淀形式存在于溶液中，也起到一定的去除DNA的作用。5、大量的乙醇洗涤在工业生产上有否危险隐患？厂家是如何考虑的？ 乙醇属于易燃易爆的危险品，大量使用一定是有危险隐患的。但是只有经过乙醇的洗涤才能除去RNA中掺杂的无机盐、色素、脂溶性杂质。高浓度的盐会水和大量的水分子，RNA分子之间容易形成氢键发生沉淀，乙醇与水任意比例互溶，因而可以洗去盐和与RNA结合在一起的水。同时，乙醇易挥发，易于除去。同时乙醇较为廉价，毒性低、回收容易，因此适于工业使用。6、本实验在用紫外法测定RNA含量时，为什么要固定测定液的pH值，若pH值不固定，会影响测定结果吗？为什么？ 会影响测定。因为紫外法需要在中性条件下测定吸光度。因为核酸在强酸或强碱条件下，会发生氢