偏头痛肝阳上亢型大鼠脾脏淋巴细胞的比较蛋白质组学分析

1、偏头痛肝阳上亢型大鼠脾脏淋巴细胞的比较蛋白质组学分析         11-05-09 16:30:00     编辑：studa20                 作者：胡建军,陈泽奇,钟广伟,李炜,尹耀慧【摘要】  目的 筛选与偏头痛肝阳上亢型相关的蛋白质,进一步揭示偏头痛肝阳上亢证的分子机制。方法 用

2、电刺激SD大鼠三叉神经节,并灌服附子汤的方法制造偏头痛肝阳上亢型模型。采用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离偏头痛肝阳上亢型大鼠脾脏淋巴细胞的总蛋白,PDQuest7.0图像分析软件识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱得到相应的肽质量指纹图,搜索数据库鉴定蛋白质。结果 鉴定到的10个差异蛋白分别为：氯通道蛋白-1、硫氧还蛋白过氧化物酶-、硫氧还蛋白过氧化物酶-、专利蛋白WO979348序列、Rho GDP解离抑制因子、肌动蛋白2/3复合物、神经微丝轻肽、蛋白酶体、热休克蛋白-27、膜联蛋白-A1。结论 这些蛋白可能与偏头痛肝阳上亢证的形成有关,本实验为进一步揭示偏头痛肝阳上亢

3、证的发病机制提供了新的线索。 【关键词】  蛋白质组学；偏头痛；肝阳上亢证；脾脏淋巴细胞；大鼠         Comparative Proteomics Analysis on Splenic Lymphocytes in Migraine Rat Model with Hyperactivity of Liver-yang  HU Jian-jun, CHEN Ze-qi, ZHONG Guang-wei, et al Xiangya Hospital Affiliated to Cent

4、ral South University, Changsha 410008, China    Abstract：Objective To explore the molecule mechanisms of migraine with hyperactivity of  liver-yang related proteins. Methods Animal model of migraine with hyperactivity of liver-yang was established through electrical trigeminal ga

5、nglion stimulation, and by administering orally with Fuzi decoction. The total proteins of splenic lymphocytes in the rats were separated by immobilized pH gradient-based two-dimensional gel electrophoresis. With coomassie blue staining, the 2-DE images were analyzed by PDQuest 7.0 software. Matrix-

6、Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) and database were used to identify the differential proteins. Result Ten differential spots protein were identified, and they were chloride intracellular channel 1, thioredoxin peroxidase , thioredoxin peroxidase ,

7、sequence 7 from patent WO9709348, Rho GDP dissociation inhibitor (GDI) alpha, actin related protein 2/3 complex neurofilament light polypeptide, proteasome subunit beta type and heat shock protein-27, annexin A1. Conclusion These protein may be involved in the development of migraine with hyperactiv

8、ity of liver-yang. These data provide useful clues for elucidating the mechanisms of migraine with hyperactivity of liver-yang.    Key words：proteomics；migraine；hyperactivity of liver-yang；splenic lymphocytes；rat     偏头痛(migraine)在以头痛为症状的疾病中占有很重要的地位,在美国,约有17.2%的女性和

9、6%的男性曾有偏头痛发作1。本病2/3患者为单侧头痛,1/3为双侧,每次发作延续数小时或数天,间隔不规律,数天数月甚至数年可再发,至今其发病机制仍未完全明确。有研究表明,偏头痛和肝阳上亢证均与免疫失调有关2-3。为此,笔者以偏头痛肝阳上亢型模型大鼠、对照组大鼠脾脏淋巴细胞为研究对象,采用双向凝胶电泳、质谱技术筛选与偏头痛肝阳上亢证相关的蛋白质,以揭示偏头痛发生发展的机制,为其治疗提供新的靶点。1  实验材料1.1  动物雄性SD大鼠20只,清洁级,体重(200±20)g,中南大学实验动物学部提供,许可证号：SYXK(湘)2005-0005。1.2  试剂

10、及药物    大鼠淋巴细胞分离液为天津灏洋生物有限公司产品；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、固化pH梯度干胶条(IPG trip, pH3-10NL, 24 cm)为Amersham公司产品；二硫苏糖醇(DTT)、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮-胰蛋白酶(TPCK-Trypsin)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)、-氰基-4羟基肉桂酸(CCA)为Sigma公司产品。附子汤由50 g单味制附子(由中南大学湘雅医院中药房提供)组成,将药物先泡30 min,煎煮两次后合并浓缩为含原药材0.32 g/mL的药液,4 保存。1.3  仪器   

11、 STOELTING TL-2鼠脑定位仪,美国产；生理电子刺激仪(SDQ-1型),蚌埠实用技术研究所产品；旋转平台,根据文献4自制；Ettan DALTSystem垂直电泳槽及ImageScanner扫描仪(Amersham公司)；PDQuest7.0分析软件(Bio-Rad公司)；EXL800自动酶标仪(Bio-Tek Instrument公司)；Voyager-DE STR 4307 MALDI-TOF-MS 质谱仪(Applied Biosystem公司)。2  实验方法2.1  造模    偏头痛模型复制参照文献5方法,实验动物予10%

12、水合氯醛麻醉(0.4 mL/100 g),在头顶作正中切口,在前囟旁3.03.2 mm(根据动物大小可变动)、后3.3 mm处用手术刀凿出一直径2 mm的小孔。操作鼠脑立体定位仪将不锈钢电极由钻孔处垂直插入,深度在硬脑膜下9.2 mm处(达三叉神经节)。应用生理电子刺激仪进行电刺激,刺激电流1.0 mA,5 Hz,波宽5 ms,持续10 min。完毕后拔除电极,缝合头皮,外敷青霉素粉剂预防感染。手术过程及苏醒期间,以60 W灯泡维持体温在37 。肝阳上亢证复制：参照鄢氏等4的方法,连续灌服附子汤2 mL/次,每日1次,共21 d,复制成偏头痛肝阳上亢动物模型。2.2  分组 

13、;   20只大鼠随机分为2组,每组10只。假手术对照组(对照组)大鼠麻醉,手术,但电极只插入4.5 mm深度,不做电刺激,缝合头皮伤口,蒸馏水灌胃2 mL/次,1次/d,共21 d。偏头痛肝阳上亢组(模型组)大鼠麻醉,手术,电刺激10 min,附子汤灌胃2 mL/次,1次/d,共21 d。实验中动物无脱落。2.3  组织标本的处理    所有动物在处死前均腹腔注射麻醉剂(10%水合氯醛0.4 mL/100 g),待动物麻醉后,剪开腹腔,找到脾脏,用预冷的生理盐水清洗后,经100目不锈钢网研磨,收集细胞悬液,用大鼠淋巴细胞分离液分离淋

14、巴细胞,转移至-80 低温冰箱备用。2.4  脾脏淋巴细胞总蛋白的提取   将标本从低温冰箱中取出,置于研磨管中,加入组织裂解液100 L(7 mmol/L尿素,2 mmol/L硫脲,100 mmol/L DTT, 5 mmol/L PMSF,4%CHAPS,40 mmol/L Tris),放入液氮中冷冻成硬块,然后转移到冰台上,反复冻融3次,4 静置1 h后,12 000 r/min离心60 min,取5 L上清用于2-D Quant Kit 蛋白定量,按试剂盒说明书的方法测定蛋白浓度,余上清冻存于-80 低温冰箱备用。2.5  双向电泳及考马斯亮蓝染

15、色    采用24 cm IPG trip,上样量为800 g,具体操作按IPGphor等电聚焦系统指南和Gorg5的方法进行。20 水化12 h,行等点聚焦,总电压时间积达64 000 Vh。聚焦后将胶条先后在含DTT和IAA的平衡液中平衡15 min,然后行12%SDS-PAGE电泳,考马斯亮蓝染色。2.6  凝胶图谱分析    凝胶通过Immage Scanner扫描仪及Lab Scan扫描软件进行扫描,获取图像；利用PDQuest 7.0分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配等分析。2.7  质

16、谱分析    选取表达有显著差异的16个蛋白质点,参照文献6方法进行。2.8  数据库查询    采用Matrixscience公司的Mascot软件搜索数据库。肽质量控制在8004 000 Da,肽片段质量最大误差控制在0.05%,酶解片段不完全选择为1个,物种来源为大鼠,离子选择M+H和monoisotopic,半胱氨酸经碘乙酰胺处理(Carbamidomethyl- Cys),信号峰采用Mascort distiller软件识别。2.9  统计学方法    采用统计软件SPSS1

17、3.0,计量资料用x±s表示,采用t检验；等级计数资料采用Wilcoxon秩和检验；计数资料采用2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。3  结果3.1  一般情况    模型组大鼠较对照组食量减少,体重减轻,毛发干枯,前肢频繁搔头,刺激测咀嚼肌收缩,有时可见口鼻分泌物增加。3.2  性情变化及旋转时间    模型组在附子汤灌胃3周后,其激惹程度发生了很大的变化,多表现为级,且有4只出现了眼结膜充血(见表1)。表1  2组大鼠性情变化、外观及旋转时间变化比较(略)注：与对照组比

18、较,*P<0.013.3  2组大鼠脾脏淋巴细胞2-DE图谱及差异蛋白质点分析  在相同条件下分别将对照组和模型组脾脏淋巴细胞总蛋白质样品进行3次双向电泳,其总蛋白分布模式非常相似,以pI38和Mr14.475 kD范围的蛋白质点最多(见图1)。经PDQuest7.0软件分析,相同条件下,识别的蛋白质斑点数分别为对照组(510±19)个,模型组(500±23)个。图像分析时将对照组的一块凝胶选为参考胶,其他凝胶中蛋白质点与其相匹配,结果模型组的平均匹配点数为(433±11),平均匹配率为85%。模型组与对照组图像分析统计后发现,偏头痛肝阳上亢组与对照组相比有16个蛋白质下调和4个蛋白质上调。见表2。表2  差异蛋白质点在模型组和对照组的表达量（略）3.4  差异表达蛋白质点的MALDI-TOF-MS质谱鉴定及数据库查询    随机选取图像分析统计后的差异大于2倍的蛋白质点,胶内酶切提取蛋白进行质谱鉴定。共得到13个肽质量指纹图谱,其中3个无质谱结果,10个搜索到具