人表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养体外模型的建立-2019年文档

1、人表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养体外模型 的建立Establishment of the co-culture model of human melanocyte and HaCaT cell in vitroMAHui-jun, TIAN Yan, LIU Wen, LI You, ZHAOGuang,YANG Qing-qi(Department of Dermatology, The Airforce GeneralHospital of PLA, Beijing 100142,China):ObjectiveTo establish an in vitro model of mel

2、anocyte and HaCaT cell co-culture model, and measured the melanin transfer effects induced bya -MSH and niacinamide usingthe model.MethodsHuman epidermal melanocyte was co- culture with HaCaT cell as 1: 2 ratio after 48 h ofmelanocyte first seeding on the dishes. Then melanin transfer was observed w

3、ith Fontana-Masson method bya -MSH and niacinamide after 1,3,5,7,9 day of co-culture separately . ResultsAbout 20% HaCaT cells that have positive melanin stain around nuclear were observedafter3 day's co-culture. With the time developed, the ratio of positive melanin stained HaCaT cell is increa

4、sing and reached its peak (80%) at the 7th day. In our model, thedose-dependent inhibitory and facilitative effects wereobserved respectively in n iac in amide anda -MSH treatedgroup.ConclusionsThe in vitro model of epidermal melanocyte and HaCaT cell co-culture system was successfully established a

5、nd it offers a new, suitable, reliable and easy tool for the clinical evaluation of melanin transfer modulators.表皮中的黑素细胞和角质形成细胞相互作用共同组成了表 皮黑素单元，起着重要的调节皮肤颜色、 防止紫外线辐射的作用。 目前研究表明， 人皮肤颜色主要受色素沉着过程的影响， 除黑素 细胞生成黑素外， 黑素小体从黑素细胞向周围角质形成细胞的广 泛传递过程在皮肤颜色调节中起着更为重要的作用 1 。目前黑 素传递的研究多采用鼠系的瘤细胞或正常人表皮黑素细胞和角 质形成细胞共培养来完成，

6、 但这两种共培养方法均有各自的局限 性，限制了该方法在药物筛选中的广泛应用2。HaCaT细胞是成人皮肤中分离的一种永生化的角质形成细胞株， 具有正常角质 形成细胞所应有的特性， 常用来替代人表皮角质形成细胞进行实 验研究 3 。笔者通过不断的摸索和比较，将人表皮黑素细胞和 HaCaT细胞进行了共同培养，并观察了a -促黑素（a -MSH、烟酰胺对该共培养模型黑素传递的影响，为大规模筛选促 / 抑黑 素传递的药物提供了实验基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 标本：正常人表皮黑素细胞来源于空军总医院泌尿外科门诊行包皮环切术的青少年 （1019岁，平均14.4岁）包皮； HaCaT细胞购自上

7、海沪尚生物科技 XX公司。1.1.2试剂和仪器：DMEI培养基、MCDB15培养基、胰蛋白 酶、角质形成细胞无血清培养基（ keratinocyte serum free medium, KSFM均为美国 Gibco公司产品，进口胎牛血清（FCS 购自海克隆生物化学制品 XX公司，左旋谷氨酰胺、分离酶（ dispase ）、碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF）， 神经生长因子-B （NGF-B ），内皮素 1（ET-1），霍乱毒素（CT）, a -MSH 烟 酰胺 （Vpp） 购自美国 Sigma 公司；分析纯硝酸银（常州市武进庙 桥第二化工XX公司），纯氨水（天津市化学试剂一厂）， 25cm

8、 培养瓶、6孔培养板（美国 Corning公司）。CKX31-A12PH倒置 显微镜、BX51TF显微镜（Olympus 公司），Forma-3111 CO2 孵 箱（鑫态国际贸易XX公司）1.2 方法1.2.1 原代黑素细胞的纯化和培养：取包皮，碘伏消毒 10 min, PBS洗涤3次，去除皮下组织，将包皮剪成1cmx 1cm的小片，0.25%分离酶4C放置1216h，眼科镊轻轻分离表真皮，用 0.25%的胰酶37C消化表皮510min，吹打成细胞悬液，200目 筛网过滤，PBS洗涤2次，参照以前的方法4稍加改良，用含 5嗚台牛血清、100U/ml青霉素，100卩g/ml链霉素，50nM C

9、T,5ng/ml bFGF , 10ng/ml NGF- B, 20 卩 g/ml ET-1 的 MCDB15培 养基稀释细胞，以4X 105/ml的细胞密度接种到25cm的培养瓶 中，37C、5%CO培养箱中常规培养。1418天后待细胞长至 80%融合状态时传代，0.05%胰酶消化细胞5min，见黑素细胞收 缩浮起，即可用含血清的培养基中和胰酶，离心收集细胞悬液， 传代培养，取 2 4 代的表皮黑素细胞用于实验。1.2.2 HaCaT细胞培养：HaCaT细胞用含10%胎牛血清的 DMEM 培养基在37 C、5%CO培养箱静置培养，每34天传代1次。1.2.3表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养

10、：将已纯化的表皮黑素细胞消化离心后以2X 104/ml的细胞密度贴壁培养于已消 毒的盖玻片上，添加黑素细胞培养基继续培养 48h 后，将 HaCaT 细胞消化离心调整细胞密度为 4X 104/ml，接种于已有黑素细胞 生长的盖玻片上，更换培养基为KSFM添加牛垂体浸出物，表皮生长因子等)， 2 天 换液 1 次，倒置显微镜下观察共培养细胞 生长及形态学变化。1.2.4 色素调节剂干预：根据文献 5 ，分别选择a -MSH( 10, 50, 100nM)以及烟酰胺(0.1 , 0.5 , 1mg/ml)于共 培养当天添加入角质形成细胞无血清培养基中，药物连续干预 3 天,中间换含有药液的培养基

11、1 次,未添加药物的培养基作为空 白对照,观察黑素细胞形态,检测黑素传递。1.2.5 Fontana-masson 染色6 ：分别取经药物干预或无药 物干预(空白对照) 1, 3, 5, 7, 9天后黏附有共培养细胞的盖玻片，浸入PBS中5min, 4嫁聚甲醛固定20min,蒸馏水冲洗3 次，入5%硝酸银-氨水溶液中56C避光孵育1h,蒸馏水冲洗， 1%氯化金溶液 10min 加强着色,蒸馏水冲洗,入 5%硫代硫酸钠 溶液还原3min，0.1%伊红复染1min，水溶性封片剂封片，显微 镜下观察并摄片，计数在 400倍光镜下随意 1 5个视野中阳性染 色的HaCaT细胞总数。黑素传递量以处理组阳

12、性HaCaT细胞数/空白对照组阳性 HaCaT细胞数x 100%示，每一实验重复 4次。1.2.6统计学分析：统计过程使用SPSS10.0统计软件完成， 米用t检验，数据均以x±s表示。2 结果2.1表皮黑素细胞与HaCaT细胞在倒置显微镜下的形态：表 皮黑素细胞在本实验选用的培养基中多呈树突状生长, 每个细胞 有24个突起，细胞增殖较快约 18天传1代；HaCaT细胞多呈 鹅卵石样或菱形生长，具有紧密黏附生长的特性， HaCaT细胞增 殖快,约 4 天传 1 代。2.2表皮黑素细胞与HaCaT细胞共培养在倒置显微镜下的 形态：黑素细胞与HaCaT细胞共培养第1天始HaCaT逐渐增多

13、， 第 9 天达到融合状态, 而黑素细胞的数量未有增加, 相反随着培 养时间的延长, 黑素细胞数量有所减少, 细胞间发生的接触增多, 黑素细胞胞体也变成多角状, 树突逐渐延长、 突起增多,常有 3 6个树突与周围多个 HaCaT细胞发生接触（图1）。2.2 Fontana-Masson 染色显示黑素颗粒：共培养第 1 天, HaCaT细胞内未见明显的黑素颗粒（图 2a），第3天可见20%勺 HaCaT细胞核周出现明显黑素颗粒（图2b），第7天约80%勺HaCaT 细胞核周出现明显黑素颗粒（图2c），继续培养则未见含有黑素 颗粒的HaCaT细胞比例明显增加。2.3 a -促黑素、烟酰胺对黑素传递

14、的影响：共培养 3天后， a -促黑素以浓度依赖方式促进了黑素细胞内黑素向HaCaT细胞内的传递，10、50、100 nM况-MSH分别使黑素传递量增加为 130% 150%和 165%；烟酰胺则以浓度依赖方式抑制了两细胞间黑素的 传递， 0.1 、0.5 、 1 mg/ml 烟酰胺分别使黑素传递量递减为90%、83%、67%（图 3）。3 讨论黑素在黑素细胞体内合成后以黑素小体的形式传递到周围 的角质形成细胞并在角质形成细胞内重新分布和降解， 从而起到 调节皮肤颜色、 抑制紫外线辐射的作用， 此过程被称为黑素传递。 黑素传递过程通过调节角质形成细胞中传递的黑素小体的大小、 数量和分布从而影响

15、着人的皮肤颜色 1 。目前，大多数的美白 产品主要是是通过抑制黑素细胞内的黑素合成来发挥作用的， 仅 发现极少数美白剂如烟酰胺等具有抑制黑素小体向角质形成细 胞内传递的作用。 由于有关黑素传递的研究起步较晚， 其确切的 机制还远未被人们所认识。以表皮中黑素细胞与角质形成细胞或各自对应的鼠瘤细胞 进行共培养建立体外细胞模型是目前研究黑素传递的主要方法，但上述方法均存在一定的缺陷 （如鼠源性的瘤细胞与人表皮细胞 尚存在较大差异；原代人角质形成细胞培养增殖慢、不易纯化、 传代易死亡等缺点） ，严重影响了该方法在大规模筛选黑素传递 调节药物中的应用 2 。因此需要建立一种简便、快捷、与人生 理状态最为

16、接近的细胞模型来替代既往的细胞模型。 我们在以前 成功纯化培养表皮黑素细胞的基础上，经过不断的摸索和实践， 将原代培养的人表皮黑素细胞与 HaCaT细胞进行混合培养，并应 用较为简便的 Fontana-Masson 银染法对共培养后的细胞是否发 生了黑素传递进行了初步验证，发现共培养细胞在KSFM培养基中生长状态良好，随着时间的延长黑素细胞的比例逐渐减少而 HaCaT细胞的比例逐渐增加，两细胞间的联系逐渐增多。与单独 培养的黑素细胞相比， 共培养的黑素细胞胞体变成多角状， 树突 逐渐延长、突起增多，常有 36个突起与周围HaCaT细胞发生 接触。提示共培养体系中HaCaT细胞可通过细胞接触发挥

17、对黑素 细胞的调控作用，这与体内情况相一致 7 。我们还发现共培养 3天后约20%的HaCaT细胞核周发现由黑素细胞传递来的黑素颗 粒。共培养 7 天后黑素传递量达到饱和状态（约80%），继续培养则未见含有黑素颗粒的 HaCaT细胞比例再增加。说明黑素细胞 与HaCaT细胞间的黑素传递在细胞接触后即可发生，当两细胞间的接触达到完全状态后， 黑素传递也相应达到饱和。 为了进一步 验证该模型的敏感性， 我们利用既往已经证实的两种黑素传递调 节剂增殖a -MSH和烟酰胺对该模型进行了测试，发现共培养3天后，a -MSH以浓度依赖方式促进了黑素细胞内黑素向HaCaT细胞内的传递， 烟酰胺则以浓度依赖方式抑制了两细胞间黑素的 传递，与以往的研究结果基本一致 5 ，从而说明该共培养模型 可很好的模拟人生理状态下表皮黑素传递过程， 从而替代原代表 皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系， 与后者相比本模型具有 细胞来源充分、研究