基因治疗用腺病毒载体研究进展

1、基因治疗用腺病毒载体研究进展录入:wei 来源:Internet 时间:2008-9-20 【字体:大中小】双击滚屏【摘要】近十年来, 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体, 各种重组腺病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系统的特点, 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法, 腺病毒生产和纯化方法及其产品的质量控制, 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题进行了阐述。【关键词】基因治疗腺病毒载体生产方法【本页关键词】省级期刊征稿硕士毕业论文写作【正文】基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达, 并因表达产物蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。人类疾病的

2、发生都是人体细胞本身的基因改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。长期以来科学家们思考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病, 这就是基因治疗的含义。从上世纪九十年代开始, 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体, 已经报道的1000 多种基因治疗的临床方案中, 约26% 是用腺病毒作为载体。腺病毒载体可以在包装细胞内高滴度复制, 是上呼吸道自然存在的温和病毒, 可以感染多种分裂期和非分裂期的细胞。第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单基因疾病, 这种病毒载体通常删除了E1 和E3 区以便插入目的基因1 , 而且要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。第二代腺病毒是复制

3、缺陷型病毒, 人们进一步删除了E2a, E2b 或E4, 降低了免疫原性及RCA 的出现。人们又构建了第三代腺病毒载体, 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒2- 4 。1、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化删除E1 和E3 区的腺病毒基因组长约36kb, 其容纳外源基因的的长度在7 8kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步: 一是扩散和吸附, 病毒扩散并吸附在细胞表面。二是结合并扩散入细胞核, 这一阶段通常通过细胞的内吞作用来完成。三是基因转录及DNA 复制。在动物细胞的大规模培养中, 限制细胞生长的因素很多, 包括所需营养的缺乏、代谢副产物的抑制、传氧速率的限制、pH 的变化和剪切力的损伤

4、等5 , 其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源物质, 它们在动物细胞的生长、繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。葡萄糖是主要的碳源和能源物质, 经细胞内的代谢过程, 绝大部分生成乳酸释放到培养液中6 , 同时提供能量(A TP 和还原力(NADH , 少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖, 仅有极少部分进入TCA 循环7, 8 , 并且直接参与了谷氨酞胺的代谢过程。2、腺病毒的定量和计数方法在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量, 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。现在生产企业

5、和学术研究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。为了不同实验室间数据能进行相互比较,美国成立了一个腺病毒参考物质工作组, 目的是建立腺病毒的参考标准品。世界上所有的研究和开发机构都可以获得此标准,以便对腺病毒的定量方法进行标准化以及方便对临床前和临床资料的解释。人们建立了阴离子交换的高压液相方法定量检测腺病毒颗粒, 该方法的可重复性和准确性较紫外分光光度计法显著提高9 。其它的方法还有荧光标记病毒DNA 以及测定病毒六邻体蛋白的方法等。有趣的是人们注意到V ellekamp 等10 近来报道了关于观察不同色谱柱纯化的腺病毒批次间病毒空壳的差异情况。3、腺病毒的生产方法腺病毒生产方法根据包装细

6、胞不同而分为贴壁细胞培养与悬浮细胞培养。主要用于E1 区缺失腺病毒生产的包装细胞为起源于人胚肾的293 细胞, 此细胞包含有腺病毒缺失的E1 区。许多悬浮和无血清驯化的细胞克隆在各个实验室可以获得, 293细胞的相关生物学特性现在已经被详细阐明, 而且正在用于符合GM P 标准的工业化生产中。免费获得该细胞系以及生产的病毒滴度高是293 细胞的主要优点。对于商业化生产而言, 悬浮细胞系比较适应大规模生产, 而且悬浮培养的细胞一般可以在无血清培养体系中培养, 不添加任何其它动物来源的添加剂, 这样就有利于分离纯化。灌注培养是对流加模式改进后的一种培养方法, 通过不断更换新鲜培基,同时应用细胞截留

7、装置使细胞保留于生物反应器内, 可以顺利实现培基的原位交换。一些作者建议用灌注培养的方法获得高密度的细胞, 然后将细胞转移到其它生物反应器中生产腺病毒。灌注培养模式已经得到了广泛的认可和接受, 并且成为腺病毒大量生产最常用的培养模式。4、腺病毒的纯化方法重组腺病毒的纯化是大规模生产中的关键问题, 最经典的纯化方法是两步氯化铯密度梯度超速离心法, 此方法是生产小量临床级产品的有效方法。但这一工艺放大困难, 需要建立适用于大规模生产的纯化技术。人们不断地努力研发可用于大规模生产的腺病毒分离纯化工艺, 如离子交换、疏水性相互作用、金属鳌合和凝胶过滤等11, 12 。近年来阴离子交换树脂已经逐渐成为主

8、要分离纯化手段, 得到了较好的结果。经常使用的阴离子交换树脂主要有Q Sepharo se XL、Source 15Q 以及DEA E 等, 回收率均能达到65% 以上, 分离效果也较好。Green 等13 提出离子交换层析后使用聚四氟乙烯树脂层析法除去第一步离子交换未除尽的宿主和病毒蛋白, 还有学者提出采用离子交换和凝胶过滤相联合的方法进行纯化, A rcand 等14 提出先进行F ractogelEMD DEA E - 650 离子交换层析, 而后进行Sephacryl S -400HR 凝胶过滤的纯化方法。最近有文献报道15, 16 , 利用阳离子去垢剂沉淀宿主DNA 方法来分离纯化腺

9、病毒, 他们的方法是首先在细胞裂解液中加入氯化十六烷基嘧啶或溴化度灭芬等阳离子去垢剂进行充分搅拌混合, 此时宿主DNA 就会被沉淀, 随后经过两次超滤去除DNA 沉淀, 最后再经过Source 15Q 分离纯化, 他们报道最后腺病毒的回收率均大于50%。这种方法的最大优点是费用低廉, 容易进行放大, 非常适合商业化生产。 5、腺病毒产品的质量控制生产过程中复制完全型腺病毒的测定非常关键, 通常是用 74 科技信息高校理科研究敏感细胞的细胞致死效应来测定, 但是这种方法周期长, 现在更灵敏的方法是PCR. RCA 的出现促使人们去寻找更可靠的包装细胞株。对重组腺病毒的质量控制贯穿于整个生产纯化过

10、程, 包括包装细胞、病毒、粗分离产品、纯化产品和最终产品。Roetsch等人17, 18 从稳定性、有效性和纯度三个方面详细报道了基因治疗中重组腺病毒的质量控制手段。稳定性包括病毒基因组的稳定性和治疗基因表达的稳定性, 前者的检测用酶切、电泳和Southern blo t 等方法。有效性包括总病毒颗粒数与病毒滴度之间的比例和具有感染效力的病毒颗粒中治疗基因有效表达的比例, 在临床治疗中病人接受的剂量用病毒总颗粒数表示。所以上述两种比例就显得尤为重要。纯度包括野生型RCA 的检测、杂蛋白污染检测, RCA s 的检测用生物法和PCR 法, 杂蛋白污染的检测用反相HPLC 和MALD I- TO

11、F 质谱联用法。6、腺病毒生产的发展趋势与存在问题在过去几年中, 新的腺病毒载体不断研制成功, 对腺病毒载体的大规模生产工艺提出了迫切的要求, 人们尝试了各种方法,通过腺病毒载体生产工艺的改进, 使得重组腺病毒的大规模生产成为可能。包装细胞的培养工艺逐渐转向无血清悬浮灌注培养方式, 以增加细胞密度, 提高病毒产量。由于目前大量的研究主要集中在包装细胞的培养工艺和腺病毒的纯化和计数方法,病毒在宿主细胞中的DNA 复制和成熟的机制知之甚少, 最终提高病毒的产率和滴度以及完善流加和灌注工艺还有赖于对病毒复制与成熟机制的了解。在整个重组腺病毒的生产纯化工艺中,纯化和计数是比较薄弱的环节, 虽然目前探索

12、了不少的纯化计数方法, 但是其中所用到的设备和材料价格昂贵, 所以还有待进一步开发适合大规模纯化要求的设备和材料, 或者成本低廉的纯化工艺。质量控制是生产中非常重要的一环, 它应该包括两方面的内容: 首先, 它不仅是对最终产品质量的把关, 还应该贯穿在整个生产过程中; 其次, 国内和国外目前对于应用在临床的重组腺病毒载体的质量标准还很不完善, 所以在质量标准的制定方面应加大研究力度, 从而提高产品的治疗效果, 减少副作用的发生。参考文献 1 Danth inne X, Imperiale MJ. P roduct ion of firstgenerat ion adenovirus vecto

13、 rs: a review. Gene Ther, 2000. 7:1707- 1714. 2 L uskyM , Ch ristM , R it tner K, et al. In vit ro and in vivobio logy of recombinant adenovirus vecto rsw ith E1, E1öE 2A , o rE1öE4 deleted. J V iro l, 1998. 72: 2022- 2032.3 Yeh P, Dedieu J - F, O rsini C, et al. Efficient dualt ranscomp l

14、ementat ion of adenovirus E1 and E4 regions from a293- derived cell line exp ressing a m inimal E4 funct ionnal unit.JV iro l, 1996. 70: 559- 565. 4 Park s RJ , Chen L ,A ntonM , et al. A helper- dependentadenovirus vecto r system: removal of helper virus by Cre -mediated excision of the viral packa

15、ging signal. P roc N at l A cadSciU S A , 1996. 93: 13565- 13570. 5 H iller GW ,A esch limann AD, Clark DS, et al. A k inet icanalysis of hybridoma grow th and metabo lism in cont inuoussuspension culture on serum - free m idium. B io techno l.B ioeng. , 1991. 38: 733- 741.6 林福玉, 陈昭烈, 刘红等. 大规模动物细胞培养

16、的问题及对策. 生物技术通报, 1999, 10 (1 : 58- 64. 7 Reitzer L. J. ,W ice B. M. , Kennell D. . Evidence thatglutam ine, no t sugar, is the majo r energy source fo r clucuredHela cells. J. B io. Chem. , 1979. 254: 2669- 2674. 8 Zielke, H. R, et al, Glutam ine: A majo r energy sourcefo r cultured mammalian cells,

17、Fed. O roc. , 1984. 43: 121- 125. 9 T ransfiguracion J , Bernier A , A rcand N ,. et al.Development and validat ion of a h igh - perfo rmance liquidch romatography - tandem massspect romet ry assay fo r thedeterm inat ion of sanfet rinem in human p lasma. J Ch romatogr BB iomed SciApp l. , 2001. 761

18、(2 : 187- 194. 10 V ellekamp G, Po rter FW , Sut jip to S, et al. Emp tycap sids in co lumn - purified recombinant adenovirusp reparat ions. Hum Gene Ther, 2001. 12: 1923- 36. 11 Gilbert PA , Garnier A , Jacob D, et al. O n - linemeasurement of GFP fluo rescence fo r the monito ring ofrecombinant ad

19、enovirus p roduct ion. B io techno l L et t, 2000. 22:561- 567.12 N adeau I, Jacob D, Perrier M , et al. 293SF metabo licflux analysis during cell grow th and infect ion w ith an adenoviralvecto r. B io techno l P rog, 2000. 16: 872- 884. 13 Green A P, Huang JJ , Sco t tMO , et al. A new scalablemethod fo r the purificat ion of recombinant adenovirus vecto rs.Hum Gene Ther, 2002. 13: 1921- 1934. 14 A rcand N , Bernier A , T ransfiguracion J , et al.A denovirus type 5 (A d5 ch romatograph ic purificat ion p rocessat 20L scale. B iop rocess J , 2003. 2: 72- 75.