低聚果糖制备的研究进展

1、第17卷第4期郑州轻工业学院学报(自然科学版V ol.17N o.42002年12月JOURNA L OF ZHENG ZHOU INSTIT UTE OF LIGHT INDUSTRY (Natural Science Dec.2002收稿日期:2002-06-01作者简介:阳元娥(1974,女,湖南省隆回市人,华南理工大学硕士研究生,主要从事糖类物质及其药物的制备与生物利用研究.文章编号:1004-1478(200204-0074-04低聚果糖制备的研究进展阳元娥,罗发兴(华南理工大学食品与生物工程学院,广东广州510640摘要:对近年来国内外生产低聚果糖所用的酶和产酶菌种,酶、细胞和菌丝

2、体的固定化技术,固定化载体及高纯度低聚果糖制备的研究进展进行了综述.在此基础上指出:在低聚果糖的制备过程中,主要应考虑降低生产低聚果糖时的葡萄糖生成量、寻找高酶活力菌株、研究简便的固定化方法、寻找更加适宜且廉价的固定化载体.关键词:低聚果糖;果糖基转移酶;固定化中图分类号:TS245文献标识码:A0引言目前,黑曲霉的果糖基转移酶已被广泛应用,低聚果糖的最大产率可达55%60%(质量分数.此外,T akeda 等报道一种真菌Scopulariopses brevicaulis 只产生低聚果糖中的蔗果三糖(1-K estose ,与其他菌不同的是,这种菌仅在胞外产生低聚果糖.1997年,Euzen

3、at 等报道一株枯草杆菌Bacillus subtilis 的蔗果聚糖酶(lea 2vansucrase 在产生菊糖的同时,还能生成低聚果糖,但与黑曲霉产生的低聚果糖不同,其主要成分是蔗果三糖.第4期阳元娥等:低聚果糖制备的研究进展752酶及菌种固定化研究2.1酶固定化研究目前,工业化生产低聚果糖的主要问题是产率不高(40%60%,进而导致蔗糖酶解过程中果糖基转移酶的成本过高.酶的固定化技术为提高果糖基转移酶的使用效率、降低成本提供了可能.因为固定化酶与游离酶相比具有较好的稳定性,且可重复回收和使用,又便于连续化操作,因而可以大大降低成本.1992年,Hayashi等3用多孔硅石吸附Aureo

4、basidium sp.的果糖基转移酶并用戊二醛交联后装柱,可保留酶活力44.4%,在30下用40%蔗糖溶液以20m L/h的流速连续反应26d,得到蔗果三糖1512g,产率为30%.1994年,Hayashe12用DE AE纤维素固定果糖基转移酶,酶活力可保留95%,在30下,用30%蔗糖溶液以35m L/h流速连续反应360h,低聚果糖(蔗果三糖、蔗果四糖含量为105g/L127g/L,产率为35%4213%.1995年,Y un等12将果糖基转移酶固定在苯乙烯衍生的多孔离子交换剂上填入玻璃柱内,用600g/L770g/L蔗糖为底物以不同流速于50连续操作30d后,初始固定化酶的活性仅丧失

5、8%.1997年,Chiang等10将Aspergillus niger和Aspergillus的果糖基转移酶纯化后共价结合在甲基丙烯酰胺高分子颗粒上,可保留酶活力达100%,以50%的蔗糖溶液进行工业化的大规模生产,低聚果糖含量可达61%. 2.2细胞及菌丝体固定化研究细胞及菌丝体固定化的研究用于酶的固定化,起初酶的固定化多是采用经提取和分离纯化后的酶,随着固定化技术的发展,省去了复杂、费时的酶提取和纯化步骤而采用含酶细胞或细胞碎片进行固定化,直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应.1990年,Y un等12用2%的海藻酸钠固定Aureobasidium pulluans细胞,与60

6、%的蔗糖溶液在55进行反应,24h后低聚果糖的含量达到55%57%.此条件下进行了60批反应(超过1200h,产率没有下降,十分稳定.1998年Cruz等13用从土壤中分离得到菌种Aspergillus japonicus的菌丝固定化生产低聚果糖.菌种在50m L由甘蔗糖蜜(总糖量的5.0%,母粉2.0%,K2HPO40.5%,MgS O47H2O0.05%和K Cl0.05%组成的最终pH=5.0的培养基中,于30以200r/min的转速摇瓶培养60h,再固定化菌丝体发酵生产低聚果糖,最适pH值为5.06.0,最适温度为55.用5.75%(细胞重量与体积之比的菌丝体(122.4I U/g,即

7、每g菌丝含酶活122.4个国际单位,65%的蔗糖溶液反应4h,低聚果糖的含量可以达到61.28%,其中,蔗果三糖占30.56%,蔗果四糖占26.45%,蔗果五糖占4.27%,蔗糖占9.6%,葡萄糖占29.12%.在此试验条件下进行23批发酵生产,固定化菌丝体没有失活.在我国,江波等14首先用2%的戊二醛和0.1%丹宁于20时处理固定化黑曲霉菌体与葡萄糖氧化酶,将菌体与酶共包埋得到固定化颗粒,所得到的共包埋产物于50,pH=5.0条件下与50%蔗糖溶液摇瓶反应24h,得到含71%低聚果糖的产品,再采用固定化黑曲霉增殖细胞与固定化葡萄糖异构酶协同作用方法,将50%蔗糖溶液通入柱式反应器,连续生产得

8、到高含量低聚果糖,产物中低聚果糖和果糖含量分别为63%和16%.固定化反应柱经连续间歇反应(每天8h,性能保持一个月以上,无显著下降.史峰等15研究了以海藻酸钙为载体包埋黑曲霉As0023孢子,培养后得到固定化增殖细胞,然后将此固定化增殖细胞填入填充床反应器中,用于确定连续化生产低聚果糖的最佳工艺参数.结果表明,在<3.5cm ×50cm小型夹套层析柱上,最佳操作参数为pH=6.5,50,体积流量1.3m L/min;扩大到<5.5cm×100cm中型填充床反应器中,确定其最佳操作参数为pH=6.5,50,体积流量6.0m L/min,在此条件下所得产品中低聚果

9、糖质量分数达53%,并且连续反应17d低聚果糖含量保持在50%以上.2.3固定化载体研究76郑州轻工业学院学报(自然科学版2002年量从20%提高到54%.在长期的生产过程中,麸质截留菌丝体很好,固定化细胞稳定.麸质是小麦面粉生产的副产物,是一种天然聚合体.麸质用于细胞固定化或者多孔部件是有其优点的,因为它可以生物降解、价钱便宜、无毒且容易买到.这种以蛋白质为基础的聚合体主要用来把真菌的抗生素装入微胶囊19、微生物的生物控制孢子截留20和含酶细胞的截留21,22.通过包含有对麸质基质有亲和力的酶的微生物细胞的截留可以使含酶细胞得以固定化,从而实现特殊的生物转化.固定化可以采用薄膜、薄片或者小块

10、的形式.3高纯度低聚果糖制备研究目前获得高纯度低聚果糖的方法有2种:一是用单酶法制得含50%60%低聚果糖的糖浆,然后用适当的方法去除其中的葡萄糖而得到高纯度的低聚果糖,可称为两步法;另一种是使用双酶法或混合酶系法,在蔗糖转化反应过程中同时消除葡萄糖的抑制作用,从而使蔗糖充分转化,同时葡萄糖转化为其他较易除去的形式,再经过简单的分离纯化得到高纯度的低聚果糖,可称为一步法.3.1两步法生产高纯度低聚果糖用两步法生产高纯度低聚果糖,由于副产物葡萄糖的抑制作用,产物中低聚果糖的含量仅为50% 60%.要想提高低聚果糖的含量,可以对上述50%60%的低聚果糖进行分离、纯化,去除其中的单糖(葡萄糖和果糖

11、.方法是用碳柱层析或碳柱层析与制备性HP LC串联,可得到95%的低聚果糖.但几种使用市售离子交换树脂柱层析分离过程的回收率都很低,因而不适于大规模生产23.另一种两步法生产高纯度低聚果糖的工艺是用葡萄糖氧化酶(G OD(或葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶C AT协同作用将单酶法制得的低聚果糖糖浆中的葡萄糖转化为葡萄糖酸,然后用离子交换法将葡萄糖酸分离除去.该法的优点是两步均可在最优条件下操作,可得87%左右的低聚果糖.江波等14以果糖转移酶作用于蔗糖制得的低聚果糖为原料,将葡萄糖氧化酶及过氧化氢酶协同作用30%的总糖,在30,pH=5.0条件下,通气反应16h,得到纯度为86.92%(总低聚果糖占总

12、糖量的低聚果糖.G OD与C AT协同作用去除葡萄糖后,产品中总低聚果糖的含量比单酶法提高了53.5%.3.2一步法生产高纯度低聚果糖该法又可以称为双酶法或混合酶系法,指在反应体系中同时加入果糖转移酶(Ftase(或呋喃果糖苷酶F fase和另1种或2种能把葡萄糖转化为其他形式的酶使其协同作用,部分或全部消去葡萄糖的抑制作用,从而提高蔗糖的转化率,得到高纯度的低聚果糖.转化葡萄糖的酶一般是葡萄糖氧化酶和葡萄糖异构酶(G I.1994年,韩国学者Y un提出用葡萄糖氧化酶将葡萄糖氧化成葡萄糖酸,以消除葡萄糖,保证蔗糖到蔗果低聚糖的反应能充分进行24.该项研究对蔗果低聚糖的生产有重要意义,它使蔗果

13、低聚糖的转化率得到大幅提高,纯度由56.5%提高到90%98%,有很高的工业化价值.4低聚果糖制备研究展望随着人们保健意识的增强,对像低聚果糖这类功能性食品的需求日益扩大,厂家如能适时投入工业化生产,市场前景将极其诱人.目前,低聚果糖主要采用固定化细胞、菌丝体和酶等进行生产,提高了转化率,降低了生产成本.但是,保持固定化细胞反应器无菌,增加糖液流速,以及去杂质和脱色脱盐等问题还有待解决.固定化酶法生产中,大规模破壁以提取胞内酶,提高酶固定化的效率,使酶在固定化过程中的失活率降低、活性稳定都是不易突破的技术难点.在低聚果糖的制备过程中,主要应考虑以下几个方面:1降低生成低聚果糖时的葡萄糖形成量;

14、2寻找高酶活力菌株;3研究简便的固定化方法,寻找更加适宜而且廉价的固定化载体.参考文献:1Y un J W.Fructoolig osaccharidesoccurrence,preparation,and applicationJ.Enzyme Microb T echnol,1996,19(2:107117.2Hayashi S,N onokushi M,Imada K,et al.Production of a fructosyltrans ferring enzyme by Aureobasidium sp.AT CC20524J.J Ind Microbiol,1990,11(5:3

15、95400.3Hayashi S,Hayashi T,K inoshita J,et al.Imm obilization of fructofuranosidase from Aureobasidium sp.AT CC20524on porous silicaJ.J Ind Microbiol,1992,15(9:247250.4Y un J W,Jung K H,Oh J W,et al.Semibatch production of fructoolig osaccharides from sucrose by imm obilizationcells of Aureobasidium

16、 pullulansJ.Appl Biochem Biotechnol,1990,24(3:229238.第4期阳元娥等:低聚果糖制备的研究进展775Y un J W,Jung K W,Jeon YJ,et al.C ontinuous production of fructo2olig osaccharides from sucrose by imm obilizedcells of Aureobasidium pullulansJ.J Microbiol Biotechnol,1992,18(2:98101.6Hidaka H,Hirayama M,Sumi N.A fructoolig

17、osaccharide producing enzyme from Aspergillus niger AT CC20611J.Agric Biol Chem,1988,52(7:11811187.7Hirayama M,Sumi N,Hidaka H.Purification and properties of a fructoolig osccharide2producing2fructofuranosi2dase from Aspergillus niger AT CC20611J.Agric Biol Chem,1989,53(5:667673.8Duan KJ,Sheu D C,Ch

18、en J S.Purification and characterization of2fructofuranosidase from Aspergillus japonicusTIT-K J1J.Biosci Biotech Biochem,1993,57(14:18111815.9Duan K J,Sheu D C,Sheu D C.K inetic studies and mathematical m odel for enzymatic roduction of fruc2toolig osaccharides from sucroseJ.Enzyme Microb T echnol,

19、1994,16(4:334339.10Chiang C J,Lee W C,Sheu D C,et al.Imm obilization of2fructofuranosidase from Aspergillus on methacrylamide2based polymeric beads for production of fructoolig osaccharidesJ.Biotechnol Prog,1997,13(4:577582. 11LH ocine L,Wang Z,Jiang B,et al.Purification and partial characterization

20、 of fructosyltrans ferase and invertasefrom Aspergillus nigerg AS0023J.J Biotechnol,2000,81(1:7384.12张伟.低聚果糖及其制备的研究进展J.生物学杂志,2000,17(1:78.13Cruz R,Cruz V D,Belini M Z,et al.Production of fructoolig osaccharides by the mycelia of Aspergillus japonicusimm obilized in calcium alginateJ.Biores ource T e

21、chnol,1998,65(12:139143.14江波,王璋.双酶法生产高纯度低聚果糖的研究J.食品科学,1997,18(9:2427.15史锋,江波,王璋.连续生产低聚果糖的最佳操作参数J.无锡轻工大学学报,2000,19(1:14.16Cheng C Y,Duan K J,Sheu D C,et al.Production of fructoolig osaccharides by imm obilized mycelium ofAspergillus japonicusJ.J Chem T ech Biotechnol,1996,66(3:135138.17Chiang C J,Hsi

22、au L T,Lee W C.Imm obilization of cell2ass ociated enzymes by entrapment in polymethacrylamidebeadsJ.Biotechnol T ech,1997,11(2:121125.18Chien Ching2shan.Imm obilization of Aspergillus japonicus by entrapping cells in gluten for production offructoolig osaccharidesJ.Enzyme and Microbial T echnology,

23、2001,29(45:252257.19Y u J Y,Lee W C.Microencapsulation of pyrrolnitrin from P seudomonas cepacia using gluten and caseinJ.JFerment Bioeng,1997,84(3:444448.20Cho C F,Lee W C.F ormulation of a biocontrol agent by entrapping biomass of Trichoderma viride in gluten matrixJ.J Biosci Bioeng,1999,87(6:8228

24、24.21Long J C,Lee W C,G uo S H.Imm obilization of cell2ass ociated enzyme by entrapping in gluten matrixJ.Bio2catalysis Biotrans form,2000,17(4:431443.22Chao H P,Lee W C.A bioelectrode for penicillin detection based on gluten2membrane2entrapped microbial cellsJ.Biotechnol Appl Biochem,2000,32(1:914.23孔德力,章学钦.高纯度低聚果糖生产技术的探讨J.食品科技,1999,(3:2731.24邹