不同心脏保存液对离体鼠心低温保存效果的对比研究

1、不同心脏保存液对离体鼠心低温保存效果的对比研究                    作者：郑岩，李伯君，李力兵，马兰【摘要】  目的 通过研究康斯特保护液(HTK液)和阜外改良液(FWM液)两种心脏保存液在低温条件下保存离体鼠心不同时间的效果，为临床应用提供依据，并探讨心脏移植手术过程中供心的临界保存时间。方法 将36只雄性SD大鼠随机分成2组(HTK组和FWM组)，每组18只。采用Langendoff装

2、置进行心脏保存前后的灌注，各实验组分别使用不同保存液灌停心脏并在低温条件下保存鼠心8 h，于灌停前及复灌后留取冠脉流出液测定心肌酶(CKMB，LDH)漏出量。灌注结束后，取心肌组织测定含水量并制作光镜标本观察心肌组织结构变化。结果 与FWM组比较，HTK组心肌酶漏出量较少，但仅有少数时间点存在显着性差异(P0.05)，心肌含水量稍低，但无显着性差异(P0.05)，心肌结构变化较轻。结论 相同保存时间的条件下，HTK液及FW液的心肌保存效果相近，理论上应都可作为心脏移植术中供心的保存液，但与FWM液相比，HTK液仍具有一定优势。 【关键词】  HTK液;FWM液;心脏保存液;心肌保护;

3、低温Abstract: OBJECTIVE To compare the efficacy of heart preservation of Histidine-Tryptophane-Ketoglutarate solution(HTK solution )and Fuwai modified solution(FWM solution)following 8 hours hypothermia preservation in the isolated rat heart mode. METHODS Male SD rats (n=36) were divided randomly to t

4、wo groups: HTK group and FWM group (n=18 in each group). The rat hearts were harvested and mounted on the Langendoff apparatus to perfuse with K-H buffer solution to estimate the leakage of enzymes of the myocardial tissue (CKMB, LDH). Then they were arrested and stored in each preservation solution

5、 (4) for 8 hours. At the end of the storage period, the rat hearts were resumed and reperfused in Langendoff model. The water content and the leakage of enzymes of the myocardial tissue were measured. At the end of the reperfusion, the myocardial specimens were made to be observed the changes of str

6、uctural through optical microscope. RESULTS The hearts stored in HTK solution have a lower level of water content and the leakage of enzymes of the myocardial tissue than those stored in FWM solution, but there were no significant differences (P0.05). Also the changes of myocardial structural in FWM

7、 group were more remarkably than in HTK group.CONCLUSION The results suggest that HTK solution and FWM solution have comparable effective for hypothermic myocardial preservation in the same storage period.Key words： HTK solution; FWM solution; Heart preservation solution; Myocardial protection; Hypo

8、thermia心脏移植术作为慢性终末期心脏病的治疗方法已被广泛接受，然而由于供心需求量逐渐增大和供心缺乏之间的矛盾，如何进一步扩大供体心脏的来源，提高供心保存质量，延长供心保存时间、减少供心移植后的再灌注损伤等，都是一直在不断研究的热点和方向。其中供心的保护，尤其是适当的离体心脏保存已成为影响手术经过，决定移植后生活质量的重要因素。目前，临床上应用的保存液主要包括Celsior液(Celsior solution，丰田保护液)、康斯特保护液(Histidine-Tryptophane-Ketoglutarate，HTK液)、UW液(University of wisconsin solutio

9、n，威斯康星大学保护液)等。如何彻底解决保存后心脏功能和心肌结构受损、何种保存液效果最佳等问题仍有争论。目前，国内也有多家医疗机构在研制各种改良的新型心肌保存液，以期能更好地保护心脏功能，减轻缺血-再灌注损伤，延长离体心脏保存时间，并同时降低使用成本，本实验所有FWM液即为其中之一。本实验拟通过研究HTK液和FWM液二种心肌保存液在低温条件下保存离体鼠心的效果，为临床应用提供依据。1 材料与方法1.1 实验动物及分组 成年雄性 SD大鼠 (体重 350400 g)36只，雌雄不限，由军事医学科学院实验动物中心提供。随机分为2组，每组18只。HTK组使用HTK液灌停和保存心脏，低温条件下保存8

10、h;FWM组使用FWM液作为灌停和保存液。二种保存液成分见表1。表1 两种保存液组成成分比较1.2 Langendoff模型的建立 大白鼠称体重后，腹腔注射戊巴比妥钠(65 mg/kg)麻醉，同时注射肝素 (3 mg/kg)。仰卧固定，行气管切开，插管连接动物呼吸机给予辅助通气，迅速开胸，于主动脉和头臂干交界处离断主动脉，取出心脏，立即放入04 K-H缓冲液中，冲洗出主动脉内的残留血液，并移至改良Langendoff灌注装置上，经主动脉根部逆行灌注K-H液，维持灌注压为100 cmH2O左右，灌注液温度维持3537 ，鼠心周围小环境温度维持在3436 。整个灌注期间用95%O2和5%CO2混合

11、气体平衡。肺动脉根部切开，使冠状动脉回流液引流充分。从开胸取心至灌注开始尽量控制在75 s内完成，以尽量缩短心肌缺血时间。连续灌注K-H液平衡30 min后，经主动脉根部单次灌注4 的心肌保存液，灌注剂量为30 ml/kg，灌注时间为2 min，心脏表面同时降温，心脏停跳后置于不同心肌保存液中保存8 h。之后重新将鼠心移至改良Langendoff装置上灌注K-H液，逐渐复温至37，使心脏复跳，并持续灌注60 min。1.3 观察指标心肌含水量=(湿重-干重)/湿重×100%1.4 统计学处理 使用SPSS 13.0统计软件处理，所测各项指标均以均数±标准差( ±s

12、)表示，组间差异采用单因素方差(One-way ANOVA)分析和SNK-q检验，P0.05为差异有显着性。心肌酶CKMB和LDH的组间比较采用双因素重复测量方差(2-way repeatedmeasures ANOVA)分析和Dunnetts检验。2 结 果2.1 心肌酶学变化 保存前留取二组平衡时的冠脉流出液测心肌酶漏出量，二组间均无显着性差异(P0.05)，随时间延长心肌酶漏出量增多。后各时间点FWM组CKMB漏出量较多，其中复灌后15 min、20 min、25 min、30 min、35 min和40 min时差异有显着性(P0.05)，见表2。2.2 心肌含水量 FWM组心肌含水量

13、(84.44%±1.16%)大于HTK组(83.59%±0.41%)，但差异无显着性(P0.05)。2.3 病理结构改变的光镜结果 低温保存8 h，各组心肌标本结构改变比较，见图1(见封三)。         3 讨 论近年来，心脏移植相关技术不断发展，在影响移植手术成功率、受体患者术后心脏功能恢复及预后等的众多因素中，离体心脏的保存质量是一个十分重要的因素1。提高离体心脏保存质量主要有两条基本措施： 通过降温和化学方法使心脏停搏，减低组织代谢需要，增强组织对缺氧损伤的抵抗力。 人工供给必要的生

14、命基质，以维持组织细胞的最低能量消耗。理想的保存液不仅要考虑到Na+、K+、Mg2+和Ca2+等重要离子的浓度，还应考虑到溶液的缓冲性、渗透压、代谢底物的储备和自由基的清除等。目前临床上最常用的离体心脏保护方法就是单次灌注低温保护供心的方法，即用冷晶体心脏停搏液直接灌注供心，后用冷晶体浸泡保存，其有效保存时间仅限于45 h，而改善停搏保存液有望延长供心保存的时间。HTK液是由Bretschneider于1975年创制的，并于1979年用于心脏手术，开始是作为心脏停跳液来使用的，随后在动物实验及临床研究中发现，HTK液在缺血状态下对器官具有保护作用，因此被认为是理想的器官保存液。1985年HTK

15、液开始作为心肌保存液应用于心脏移植手术。目前，HTK液是应用最广泛的一种细胞内液型器官保存液。FWM液是国内自行研制的心肌保存液之一，其组成成分综合了HTK液和UW液各自的一些特点，也是一种低钠的细胞内液型保护液。它们的主要特点3.1 HTK液及FWM液均为低钠的细胞内液型器官保存液。HTK及FWM液的钠离子浓度均为15 mmol/L，与细胞内钠离子浓度相似，使用此种保存液灌洗供心后，细胞外Na+浓度明显下降，由于心肌细胞内外离子平衡，Na+电流无法形成，可减少缺血期间钠离子内流，使动作电位不能生成，保证心肌在较低的钾离子浓度情况下舒张期停跳，保存了心肌能量，同时防止了由于Na+、水移动而引起

16、的细胞水肿。3.2 HTK液及FWM液中的缓冲物质为组氨酸-组氨酸盐酸缓冲系统，其缓冲能力远远大于传统保存液中的缓冲系统。对于一个器官的保存液来说，缓冲成分是十分重要的。停搏液中的缓冲成分可以抵抗H+的聚积，解除对糖酵解的抑制，从而保持较大的ATP生成速率。与其他缓冲液相比，组氨酸缓冲系统能最好地满足上述要求。实验证明含组氨酸缓冲对的停跳液有效地保存了心肌的ATP 水平，减少了再灌注导致的心肌坏死 。3.3 HTK液和FWM液中均含有-酮戊二酸和色氨酸。-酮戊二酸是三羧酸循环代谢过程中的中间产物，它可以通过三羧酸循环、呼吸链及氧化磷酸化产生ATP，为缺血再灌注器官提供能量。Hachida 等实

17、验后认为-酮戊二酸及色氨酸能促进心肌在缺血-再灌注期间ATP 的产生，维持心肌细胞完整性，减轻了细胞的水肿，提高了心肌的顺应性及收缩功能。3.4 HTK液和FWM液中都加入了非渗透因素，如甘露醇、棉子糖等。低温可导致Na+、Cl-内流，水分随Na+内流进入细胞，使细胞发生肿胀。甘露醇等非渗透性低温保护剂，可产生一定的渗透压，抑制Na+、水内流，从而有效防止细胞水肿。同时，甘露醇还可作为氧自由基清除剂，在再灌注开始时能发挥一定的心肌保护作用。3.5 与FWM液相比，HTK液具有微钙的特点，其Ca2+为0.015 mmol/L，明显不同于FWM液的无钙。适当浓度的Ca2+将有助于减轻由于钙超载(C

18、alcium overload)引起的心肌细胞损伤，加强心脏功能的恢复。Kwansong等的实验表明HTK液的心脏保存效果优于UW等其他同类保存液，本实验结果也得出相同结论，HTK液和FWM液的低钠和非渗透性物质减轻了心肌细胞水肿的发生，心肌含水量较少，病理改变上表现为心肌细胞及间质水肿程度较轻;而强大的缓冲系统和所提供的能量底物减轻了细胞酸中毒的同时，增加了能量物质ATP的生成，使离体鼠心在恢复灌注后复跳满意，心肌酶漏出较少，心肌含水量较低，这些改变在HTK液组更为明显。4 结 论根据本实验结果，可以认为，HTK液及FWM液心脏保存效果好，主要表现在心功能恢复好，心肌酶漏出量少，心肌水肿较轻，病理改变较轻，因此适合用于离体心脏保护，但与FWM液相比，HTK液仍具有一定优势。【参考文献】  1 解水本，张载高，贝亚军，等.长时间供心保护的原位心脏移植 J.海军总医院学报，2005，18(4)：219-221. Bretschneider HJ.Myo