花生NAC转录因子的克隆及转录特征

1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(3: 541 545 /zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw 本研究由国家自然科学基金项目 (30771297, 广东省自然科学基金 (06025049, 广东省教育厅自然科学重点项目 (C10033资助。*通讯作者 (Corresponding author: 李玲 , Tel: E-mail: lilab第一作者联系方式 : E-mail: liu5210500Received(收稿日期

2、: 2008-08-20; Accepted(接受日期 : 2008-10-06.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00541花生 NAC 转录因子 AhNAC2和 AhNAC3的克隆及转录特征刘 旭 李 玲 *华南师范大学生命科学学院 / 广东省植物发育生物工程重点实验室 , 广东广州 510631摘 要 : NAC 转录因子是特异存在于植物中具有多种生物功能的新型转录因子。 本实验从花生中克隆了 2个 NAC 基 因 AhNAC2和 AhNAC3(GenBank登录号为 EU755023和 EU755022; 蛋白序列分析表明 , 两者具有典型 NAC 转录因 子特征

3、 , N端含有保守 NAC 结构域。半定量 RT-PCR 显示 , 在 ABA 和 GA 3处理 , 以及控水和低温条件下 , AhNAC2和 AhNAC3在花生组织中的表达上调 , 呈现不同的表达模式。 AhNAC2和 AhNAC3为典型的 NAC 转录因子新基因 , 蛋 白序列与拟南芥 RD26同源性较高 , 推测与响应干旱和 ABA 信号有关。 关键词 : NAC 转录因子; 基因表达调控; 信号转导Cloning and Characterization of the NAC-Like Gene AhNAC2 and AhNAC3 in PeanutLIU Xu and LI Ling

4、*Guangdong Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, ChinaAbstract: NAC transcription factors existed differentially in plant are the new transcription regulatory factors with multiple bio-logical functions. Two N

5、AC-like genes from peanut were cloned by RT-PCR and RACE methods, named AhNAC2 and AhNAC3 (GenBank accession No. EU755023 and EU755022, which contain an ORF of 1 050 bp and 1 008 bp and encode 349 and 335 amino acids, respectively. Gene sequence analysis showed that the putative protein of both two

6、genes contained conserved NAC domain and highly different C terminal which is the typical characteristics of NAC transcription factors. Meanwhile, the transcrip-tion levels of the two genes were investigated by semi-quantitative RT-PCR, and the result showed that the expressions of Ah-NAC2 and AhNAC

7、3 genes were enhanced by ABA, GA3, water stress, and cold stress respectively. Furthermore, the two genes expressed constitutively in peanut tissues, and their expression patterns were different in various tissues. In conclusion, AhNAC2 and AhNAC3 genes isolated from peanut were new members of NAC t

8、ranscription factor family, their comparison to RD26 (AT4G27410 reveals a high amino acid homology. We suggested that they play key roles in ABA signal transduction and drought response in peanut.Keywords: NAC transcription factor; Gene expression and regulation; Signal transduction花生各个发育期的植株对水分和温度的

9、需求不同 , 特别在开花下针期、 结荚期和饱果成熟期对高温和缺水十 分敏感 , 干旱已成为影响花生经济重要因素 1-2。高等植物的生长发育和抗逆响应都通过其转录因子 调控目的基因表达 3。 NAC 转录因子是特异存在于植物 中具有多种生物功能的一类新型转录因子 4。 NAC 蛋白 家族成员 N 端含有保守 NAC 结构域 , 可结合 DNA 和其 他蛋白 5, C端为高度变异的转录激活区 6。 目前在十多种 植物中发现 NAC 基因 , 功能涉及植物体生长发育、激素 调控、胁迫响应等重要方面 4。 NAC 家族成员众多 , 拟南芥 NAC 转录因子 ATAF1的表达受干旱和 ABA 处理诱导

10、, 负调控渗透胁迫反应 7。 过表达 NAC 基因 (SNAC1 的水稻 抗旱性增强 8。冷和盐胁迫诱导水稻 SNAC2基因表达 , 其 转基因植株显著提高对冷和盐胁迫的抗性 9。拟南芥中 3个 NAC 基因 (ANAC019、 ANAC055和 ANAC072 的过表达 显著增强转基因植株的耐旱能力 10, ANAC072 (RD26 参 与 ABA 的信号途径 , 其过表达显著增强植株对 ABA 的敏 感性 11。目前对作物的 NAC 基因研究较少 , 本试验从花生中 克隆到 2个 NAC 新基因 AhNAC2和 AhNAC3, 分析其序542作 物 学 报 第 35卷列特征和表达特性 ,

11、 为探讨 NAC 基因在 ABA 提高花生抗 旱性中的功能提供基础。1材料与方法1.1实验材料花生粤油 7号为耐旱品种 , 由广东省农业科学院作物 研究所提供。1.2cDNA 克隆与序列分析根据已报道的植物 NAC 基因保守区序列 , 设计简并 引物 NAC-L1、 NAC-R1和 NAC-R2 (表 1, 提取叶片总 RNA, 逆转录为 cDNA, PCR扩增目的片段 ; 以引物 3' RACE-T 逆 转 录 得 cDNA 模 板 , 分 别 用 NAC2-L1、 NAC2-L2、 NAC3-L1 和 NAC3-L2(表 1 与 3' 接头引物 3' RACE-R

12、进行槽式 PCR 扩增 3' cDNA末端片段 ; 利用 NAC2-R1、 NAC2-R2、 NAC3-R1和 NAC3-R2分别与 5' RACE Outer Primer(5' ROP和 5' Race Inner Primer(5' RIP (表 1 扩增 5' cDNA末端片段。 设计引物 NAC2-F 、 NAC3-F 和 NAC2-R 、 NAC3-R(表 1 进行 PCR, 获得中间未知序列。 通过软件整合测序结果 , 基于 NCBI 的 Blast 和 GenBank (/BLA

13、ST进行序列对比 , 采用 Bannai 等 12的 iPSORT 运算法则预测核定位序列 ; 使用 DNAMAN 和 DNAStar 等分析基因的预测蛋白读码框 (ORF、分子量、亲 /疏水性 , 并建立相关 NAC 蛋白系统 进化树。表 1克隆 NAC 基因中所用引物序列 Table 1 Primers used in isolating NAC genes引物名称 Primer引物序列Primer sequence (5'3'引物名称Primer引物序列Primer sequence (5'3'NAC-L1 AANGGNGGNCCNAARKCTAARRTA

14、 NAC4-F GAAGAGGAGATTTACTACGGTCTGANAC-R1 GARTGGTAYTTYTTYWSNCCNAG NAC4-R GTACAAAACGTGATTCATGTGGCTCANAC-R2 RACNARRGCTTTCTTRATNCC NAC3-F CAGAGGAAGGAAAAGAGTTCAAGAANAC2-L1 GAATGGTACTTCTTTAGTCCGAGGGA NAC3-R CACAAGGCCTTGACAATGACAATGCANAC2-L2 GCTCTGGTTTTCTACATTGGTAAGG 3'RACE-R GACTCGAGTCGACATCGNAC3-L1 CT

15、GGCAACCATTTCTCACTTCCTAT 3'RACE-T GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT NAC3-L2 CACTACCGAAGGCAGAAAAGTTGGA 5'ROP CATGGCTACATGCTGACAGCCTA5'RIPCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG 引物序列中 N 代表 A 或 G, R代表 C 或 T, K代表 T 或 G, W代表 A 或 T 。 5' RACE Outer Primer (5' ROP和 5' RACE Inner Primer (

16、5' RIP 由 TaKaRa 公司 5'RACE 试剂盒提供。N: A or G, R: C or T, K: T or G, W: A or T in primer sequence. 5' RACE Outer Primer (5' ROP and 5' RACE inner Primer (5' RIP produced by TaKaRa company.1.3植物激素和胁迫处理三叶期幼苗分别在含 100 µmol L1ABA(脱落酸 、 20 µmol L1GA 3(赤霉素 和 20 µmol L1 6-

17、BA(细胞分裂素 的 MS 培养基中培养。在不加任何激素的 MS 培养基培养的 植株为对照。按 Wan 和 Li 13的方法对三叶期幼苗进行控水处理 0、 1、 2、 4和 6 h, 高盐处理 (含 250 µmol L1NaCl 的 MS 溶 液 0、 12和 24 h和低温处理 (4培养 0、 12和 24 h, 对 照 (CK为 MS 0培养基培养的植株。1.4半定量 RT-PCR 分析基因转录水平的变化取等量 RNA 为模板 , 以花生 18S rRNA基因 14为内 参 (18S-F: 5'-ATT CCT AGT AAG CGC GAG TCA TCA G-3&#

18、39; 和 18S-R: 5'-CAA TGA TCC TTC CGC AGG TTC AC-3' 。 利 用 非 编 码 区 特 异 引 物 NAC3-F 、 NAC3-R 、 NAC4-F 、 NAC4-R(表 1 进行 One Step RT-PCR扩增。预 实验确定 PCR 循环数为 28个 (内参基因 15个 。 用半定量 RT-PCR 检测不同处理和组织的基因转录水平。2结果与分析2.1NAC 基因的克隆和序列分析克隆的花生 AhNAC2和 AhNAC3, cDNA序列全长分 别为 1 565 bp和 1 276 bp, 开放读码框为 1 050 bp和 1 008

19、 bp, 分别编码 349和 335个氨基酸残基 , 相对分子量为 39.1 kD和 37.7 kD, 蛋白等电点分别为 7.38和 6.36。 生物 信息学分析表明 , 两基因 N 端大约 180个残基区域含有 NAC 结构域 , 包括 5个保守的亚结构域和核定位序列 (图 1和图 2, 蛋白 C 端高度变异。 AhNAC2与大豆 GmNAC4和 拟 南 芥 ANAC072的 同 源 性 分 别 为 82.4%和 71.1%, AhNAC3与 GmNAC3和 ANAC072的同源性分别为 76.6%和 68.7%。 系统进化分析表明 (图 3, 两基因与拟南芥中的 ANAC072 (RD26

20、 及大豆的 GmNAC3和 GmNAC4的亲缘 关系较近。两个基因的 cDNA 序列 2007年已在 GenBank 上注册 , 登录号分别为 EU755023和 EU755022。 2.2AhNAC2和 AhNAC3在花生组织的表达图 4表明 , 在成熟叶、幼叶、根、荚果和未成熟种子 中皆有 AhNAC2和 AhNAC3表达 , 其中 , AhNAC2在幼叶、 根、 荚果和未成熟种子中的表达量高 , 在成熟叶的表达较 弱。 AhNAC3在叶片表达量较高。2.3植物激素对 AhNAC2和 AhNAC3表达的影响ABA 增加 AhNAC2和 AhNAC3表达 (图 5, 处理 12 h后 , A

21、hNAC2表达量高于 AhNAC3, 随着处理时间的延长 ,第 3期 刘 旭等 : 花生 NAC 转录因子 AhNAC2和 AhNAC3的克隆及转录特征 543 图 1AhNAC2和 AhNAC3的核苷酸序列预测的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AhNAC2 (A and AhNAC3 (B黑色方框部分为保守的 NAC 结构域 ; 红色下划线部分代表预测的核定位信号 (NLS。The conserved NAC domain of NAC gene is in black boxes; the two red

22、 underline sequences are putative nuclear localization signal. 图 2AhNAC2和 AhNAC3与其他 NAC 蛋白的 NAC 结构域比对Fig. 2 Comparison of NAC domain alignments between AhNAC2, AhNAC3 and some other NAC proteinsA 、 B 、 C 、 D 、 E 的黑框分别代表 NAC 结构域中 5个保守的亚结构域。Conserved subdomains A to E are shown by black frame in the N

23、AC domain.544作 物 学 报 第 35卷 图 3AhNAC2和 AhNAC3与其他 NAC 蛋白系统发生关系Fig. 3 Phylogentic tree of AhNAC2, AhNAC3 and some other NAC proteins水稻 OsNAC1和 OsNAC3基因的 NCBI 登录号分别为 AB028180和 AB028182; 拟南芥 ANAC072/RD26和 ANAC002/ATAF1基因的 NCBI 登录 号分别为 AT4G27410和 AT1G01720; ANAC018/NAM、 ANAC091/TIP、 ANAC022/NAC1、 ANAC098/

24、CUC2、 ANAC068/NTM1、 ANAC029/NAP基 因的 NCBI 登录号分别为 AT1G52880、 AT5G24590、 AT1G56010、 AT5G53950、 AT4G01540和 AT1G69490;大豆 GmNAC3和 GmNAC4基因的 NCBI 登录号分别为 DQ028771和 DQ028772; AhNAC1基因的 NCBI 登录号为 EU669863。The above proteins include OsNAC1 (AB028180 and OsNAC3 (AB028182 in rice; ANAC072/RD26 (AT4G27410, ANAC00

25、2/ATAF1 (AT1G01720, ANAC018/NAM (AT1G52880, ANAC091/TIP (AT5G24590, ANAC022/NAC1 (AT1G56010, ANAC098/CUC2 (AT5G53950, ANAC068/NTM1 (AT4G01540 and ANAC029/NAP (AT1G69490 in Arabidopsis thaliana; GmNAC3 (DQ028771 and GmNAC4 (DQ028772 in soybean; AhNAC1 (EU669863 in peanut.AhNAC2和 AhNAC3转录水平不断增强 , 24 h

26、后两者之间 差异不明显 ; GA促进 AhNAC2和 AhNAC3表达 (图 5, 处 理时间延长 , 转录水平不断增强 , AhNAC2在处理 36 h之 间表达量变化小 , 624 h间变化较大 ; 6-BA处理 3 h的叶 片 , 2个基因表达提高 , 处理 6 h后转录水平降低 , 12 h表 达量又升高 , AhNAC3在 12 h和 24 h的表达量高于 AhNAC2(图 5 。2.4控水、 高盐和低温对 AhNAC2和 AhNAC3转录水平 的影响控 水 处 理 1 h后 , 花 生 根 和 叶 片 中 AhNAC2和 AhNAC3的表达上升 , 根中 AhNAC2的表达高于 A

27、hNAC3, 两基因表达量随控水时间延长不断增加 , 两者间差异不 明显 ; 与对照相比 , 4处理使 AhNAC2和 AhNAC3表达均 上调 ; 250 µmol L 1 NaCl的处理对 AhNAC2和 AhNAC3表 达影响不明显 (图 6 。3讨论NAC 转录因子广泛参与生长发育、激素调控和环境 胁迫的应答 , 是一类调节植物体内各种生理反应的关键 图 4RT-PCR 分析 AhNAC2和 AhNAC3在花生组织中的表达 Fig. 4 Tissue specific expression of AhNAC2 and AhNAC3 in peanut by RT-PCRYL:

28、 幼叶 ; OL: 成熟叶 ; R: 根 ; IS: 未成熟种子 ; P: 荚果。 YL: young leaf; OL: mature leaf; R: root; IS: immature seeds; P: pods. 图 5不同激素处理对 AhNAC2和 AhNAC3的影响Fig. 5 Effects of different phytohormones on AhNAC2 and AhNAC3 expressions第 3期 刘 旭等 : 花生 NAC 转录因子 AhNAC2和 AhNAC3的克隆及转录特征 545 图 6控水、高盐和低温条件下 AhNAC2和 AhNAC3表达Fig

29、. 6 Expression patterns of AhNAC2 and AhNAC3 under water, high salt, and cold stresses因子。本文首次报道两个花生 NAC 转录因子 AhNAC2和 AhNAC3, 其结构上均有植物 NAC 转录因子典型的特征 , 如蛋白 N 端保守 , C端存在高度多变且频繁出现简单重复 氨基酸的转录激活区。 AhNAC2和 AhNAC3与拟南芥 ANAC072(RD26及大豆 GmNAC3和 GmNAC4亲缘关系较 近 , 对后者的功能分析尚缺乏报道。已知 , RD26属于 AtNAC3亚家族 15, 该亚家族的成 员多受

30、干旱和 ABA 诱导表达 10, RD26参与干旱和 ABA 的信号途径 11, 由此推测 AhNAC2和 AhNAC3可能具有 RD26类似功能 , 响应干旱和 ABA 信号。 本实验发现控水 条件下和外源 ABA 处理 , 使花生 AhNAC2和 AhNAC3基 因表达上调 ; AhNAC2和 AhNAC3在外源 GA 处理和冷胁 迫条件下表达也上调 , 预示它们可能参与冷胁迫响应和 GA 信号 ; 但是 , 两基因的表达在高盐处理期间没有明显 变化。外源 6-BA 处理 012 h, 基因表达不稳定。说明 AhNAC2和 AhNAC3基因具有特殊作用 , 有待进一步研究。 目前 , 大多

31、数 NAC 转录因子的功能尚不清楚 , 分析 NAC 基因在植物中的表达模式 , 对于明确其功能 , 阐明 转录水平对植物激素调控及逆境胁迫的应答机制具有重 要的意义。本结果表明 , AhNAC2和 AhNAC3基因可能是 组成型表达的转录因子 , 存在不同的表达模式。 本实验室 正 在 开 展 其 转 录 活 性 和 转 基 因 的 后 续 研 究 , 旨 在 探 讨 NAC 基因在 ABA 提高花生抗旱性中的机制。References1 Giayetto O, Cerioni G A. Water stress in peanut (Arachis hypo-gaea L. J Peanu

32、t Sci, 2002, 31: 19232 Wang S-B(万书波 , Feng H-S(封海胜 , Zhang J-C(张建成 . National competition by building a strong peanut industry. J Peanut Sci (花生学报 , 2003, (suppl: 510(in Chinese3 Singh K, Foley R C, Onate-Sanchez L. Transcription factors inplant defense and stress response. Curr Opin Plant Biol, 200

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