口服外源SOD的完整生物大分子吸收的研究

1、口服外源SOD的完整生物大分子吸收的研究摘要分别用Cu2+，降解成多肽的无活性的SOD和完整SOD对ICR小鼠灌胃，发现Cu2+不引起血液中红细胞SOD的活性变化，而降解后的无活性的SOD却能使红细胞中SOD活性升高，可见降解后的SOD片段可能诱导了内源SOD的生成，口服完整的SOD也能使其活性升高，通过Western-blotting分析，找到了完整的SOD分子经胃肠道吸收、穿过了红细胞膜，进入了红细胞内的证据。关键词SOD；口服；吸收；Western-blotting Studies on Oral Delivery of Exogenous BovineCu.Zn-SOD Absorpt

2、ion by Rat ErythrocytesHe Huajun， Shi Huijuan ， Yuan Qinsheng(Institute of Biochemistry, East China University of Science& Technology, Shanghai 200237)AbstractOral delivery of Cu2+,degraded inactivated SOD and native SOD to rats respectively. It is found that only oral administrated of Cu2+ can not

3、change the activity of the extract of erythrocyte. However, the degraded and native SOD both increased intracellular erythrocyte SOD activity. By western-blotting analys is, further verified the complete native SOD absorption by rat erythrocyte . The possible mechanism is also discussed.Key WordsSOD

4、 ，Oral delivery ，Absorption ，Western-blotting自从1969年McCord和Fridovich12。SOD作为药用酶，临床应用多为胃肠道外注射。虽然一系列的实验表明了SOD的有效性及持久性3，4，但口服后血红细胞SOD的升高是由于通过降解的多肽诱导内源SOD的生成还是具活性肽段的吸收，或者完整的外源SOD吸收？本文分别用Cu2+、降解成多肽的无活性的SOD和完整SOD对ICR小鼠灌胃后研究其在血红细胞中的吸收，并探讨了其可能的机制。1材料与方法11实验材料牛血Cu.Zn-SOD(300万U/g),上海宝安生物技术公司；ICR小鼠，中科院上海实验动物中心

5、；丙烯酰铵（Acr），N，N-亚甲双丙烯酰铵（Bis）等均为电泳纯，购自上海生化所西巴斯生物公司；AP标羊抗小鼠IgG及NBT/BCIP试剂盒，华美生物工程公司；其余为进口或国产分析纯。12实验方法121小鼠灌胃及取血样5取22(2gICR小鼠，禁食24h，每只灌胃0.2ml,内含目标物溶于NaHCO3溶液（1.5g/100ml,pH8.2），而Cu2+溶于PBS缓冲液（NaCl8g,KH2PO40.24g,Na2HPO41.44g,KCl0.2g,1000ml,pH7.4）;对照组灌胃相应的0.2ml缓冲液；每组5只。于灌胃后一定时间眼眶放血，取血0.8ml，肝素抗凝，加预冷的PBS缓冲液，

6、3500r/min，15min；然后PBS缓冲液洗3次，每次1500r/min，5min。取血红细胞0.3ml,加入等量去离子水溶血，然后乙醇、氯仿沉淀，取上清测SOD活力及进行SDS-PAGE。122SOD活力测定用改进的邻苯三酚法6。123SDS-PAGE按浓缩胶5%，分离胶15%进行，操作见文献7。124小鼠抗单亚基SOD血清的制备取一定量SOD，于变性缓冲液中（50mmol/LpH6.8Tris-HCl,2%SDS,100mmol/L二硫苏糖醇，20%甘油），混匀，沸水浴35min，4对PBS缓冲液透析过夜，得到变性的单亚基SOD。常规免疫小鼠，共4次，用免疫双扩散实验测得其对变性单亚

7、基SOD的效价为132，分装于-20，保存备用。125变性SOD的制备取单亚基SOD10mg，在人工胃液（50mg胃蛋白酶，pH1.52的稀HCl5ml）中降解24h，用1mol/LNaOH调pH至7.4终止反应。126Western-blotting7SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭液（5%脱脂奶粉，0.02%Tween20,溶于PBS缓冲液）封闭12h，一抗用1100稀释的小鼠抗血清，PBS洗310min，再用TNB缓冲液（50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNaCl,pH7.5）洗，二抗用AP标的羊抗小鼠IgG（5%脱脂奶粉，0.02%Tween20

8、,溶于TNB缓冲液）。TNB缓冲液洗310min，NBT/BCIP显色至适度。2结果21Cu2+灌胃对血红细胞SOD活性的影响用含Cu2+，0.110(mol/L的PBS缓冲液0.2ml对ICR小鼠灌胃，取血红细胞上清测SOD活力，未见其活力的显著变化（数据略）。22降解的SOD对血红细胞SOD活性的影响降解的SOD经测活证实无SOD活性，而且15%的SDS-PAGE凝胶已显示不出降解SOD片段的大小，可见SOD被降解成小分子的肽段。按每只0.5mg灌胃，以时间对SOD活力变化的百分数作，结果见1。从1可知，降解的无活性SOD可引起细胞内SOD活力升高，至7h达到121.4%。Fig 1Ora

9、l administration of degraded SOD onthe SOD activity of erythrocytes23灌胃完整SOD对血红细胞SOD活性的影响分别用每只0.5mg，2mg，5mg和50mg的量对小鼠灌胃，测其SOD的活力，了解其对血红细胞的活力影响，以时间对SOD活力变化的百分数作见2。Fig 2Oral administration of native SOD on the activity of erythrocytes从2可以看出，口服完整SOD能使血红细胞中的SOD活力升高。且随时间变化渐渐升高，然后达到一高峰，再慢慢恢复到原水平。而且随SOD剂量的

10、不同其达活力最高峰的时间和变化程度略有不同。24SDS-PAGE及Western-blotting分析3是血红细胞SOD提取物的SDS-PAGE，可以看到在Mr16000附近有一清晰的条带，为SOD带。Cu.Zn-SOD分子由两条相同亚基组成，牛血SOD的Mr约为32000，在变性条件下两个亚基会分开，所以SDS-PAGE上可见其Mr为16000。从对照来看，其内源SOD带亦存在。因为内源小鼠SOD和外源牛的SOD的Mr相差不多，所以从SDS-PAGE上显示不出差别。1.Protein marker（Mr）2.Partial degraded SOD3.Standard SOD sample4

11、-9.Oral delivery 5mg SOD after 1,3,5,7 and 9h,respectivelyFig 3 SDS-PAGE of samples of erythrocytes after oral delivery of SOD4为Western-blotting的谱，4A为标准品、标准品加入小鼠血红细胞样及小鼠血红细胞样。可见小鼠免疫得到的抗血清与内源的SOD的反应检测不到。而牛血SOD与其发生免疫反应，产生清晰的条带。4B为灌胃每只50mg血红细胞样的Western-blotting的分析谱，在5h，7h处可见与标准SOD相符的条带，可见与标准SOD具有相同的免疫原

12、性，证实了完整的外源SOD进入血红细胞。A:1.standard SOD sample2.Standard SOD plus control extracts3.2dilute to line 24.10dilute to line 25.20dilute to line 267.ControlB:1.Blank2.Standard SOD37.Oral delivery 20mg,1,3,5,7and 9h,r espectively8.Control9.Protein marker（Mr） Fig 4 Western-blotting of samples of erythrocytes3

13、讨论SOD是生物大分子，Mr为32000，虽然实验表明其免疫原性很低,但有报道8多次注射仍有抗体的产生，所以口服不仅是一条方便而简单的途径，而且可以避免免疫反应的产生。但是作为有活性的酶，能否被吸收进入血液循环？本室曾5研究了SOD在口服吸收过程中对胃、肠道内胃酸及蛋白水解酶失活的耐受力，及小鼠SOD口服后血细胞中SOD的活力变化情况。结果表明：在一定时间内，SOD对模拟胃酸及蛋白水解酶作用的残存活力均超过80%，口服10100U/g体重小鼠SOD后，12h内血红细胞中SOD活性均呈峰型增加，峰值变化为44%100%;吸收的动力学曲线符合Michaelis-Menten方程。此外，牛主动脉内皮

14、细胞培养试验表明：细胞对荧光标记SOD有透过作用。黄维华等9以放射性标记的125I-SOD和酶活性两方面证实：口服SOD后，提高了红细胞内SOD的活力，并探讨了其可能的作用机制。Regnault等10研究了口服0.520mgSOD/kg鼠SOD和脂质体包裹的SOD以及在脂质体中含N-脂酰鞘氨醇包裹的SOD，其生物利用度分别为14%、22%和51%。口服吸收试验一般用放射性标记或荧光标记，事实上，如果在SOD胃肠道降解成小分子进入血液循环后，其放射性强度和荧光仍然在血液中可检测出来；另一方面，SOD降解的某一小肽段能穿过细胞膜，也许仍具有SOD的部分活性，因此活性检测不具有专一性。而且据报道11

15、，一般细胞和非分化细胞中存在脱辅基SOD（Apo-SODpool），在人的淋巴细胞中脱辅基SOD占总SOD的35%左右，因此降解的Cu2+、Zn2+若穿过细胞膜，仍会引起SOD活性的提高，但本实验表明在直接灌胃Cu2+没有引起血红细胞SOD的活性显著变化。可能是因为Cu2+为抗重金属系统所吸收。所以找到直接的证据对阐明SOD生物大分子的吸收和作用机制具有重要的意义另一方面，SOD作为外源生物大分子，在血液中的半衰期很短，但有试验证明2，注射酶与药物动力学的快速清除不同的是，其作用可持续几周甚至几个月。Edeas等12用免疫细胞化学方法检测与不同量的外源SOD孵育的外周血淋巴细胞中的Mn和Cu,ZnSOD，证实SOD穿过了细胞膜，且24h后总的SOD活力提高。本研究发现，口服降解的无活性SOD能使红细胞中SOD活性升高，可见降解后的SOD片段可能诱导了内源SOD的生成；这进一步证实了文献9的推论。Emerit等3用流动细胞仪和共聚焦激光光谱，可见荧光标记的SOD快速吸附到单细胞、淋巴细胞表面，缓慢地被吞入细胞内。而本文通过Western-blotting分析，找到了完整的SOD分子经胃肠道吸收，穿过了红