口服型聚丙交酯胰岛素微囊的初步研究

1、口服型聚丙交酯胰岛素微囊的初步研究摘要：目的：为保护胰岛素口服后不被肠道酶分解，用聚丙交酯包裹胰岛素制成口服型微囊（PLA-MCI），对其活性进行初步研究。方法：PLA -MCI体外释药胰岛素测定用福林-酚法。体内活性通过糖尿病大鼠口服后血糖变化反映。结果：体外释药实验显示PLA-MCI自30min开始释药，610h已释放6 5%80%，持续释药达108h。将释药后的上清液注入糖尿病兔，其中的胰岛素仍保持降血糖的生物活性。34只非空腹糖尿病大鼠口服PLA-MCI （含胰岛素2.5mg），平均血糖下降(5721)%，峰时为712h，持续作用(84)h，血糖下降幅度与剂量正相关。结论：PLA-MC

2、I 保持了胰岛素生物活性，具有新的药理作用模式。关键词：口服型胰岛素；聚丙交酯；微囊化胰岛素A tentative study of the insulin-loaded polylactide microspheresMa Xueyi (Ma XY)(Department of Endocrinology, Beijing 304 Hospital of PLA, Beijing 100037)Pan Guomin (Pan GM)(Department of Endocrinology, Beijing 304 Hospital of PLA, Beijing 100037)L Ze (L

3、u Z)(Department of Endocrinology, Beijing 304 Hospital of PLA, Beijing 100037)ABSTRACT：OBJECTIVE：In order to protect insulin from degradat ion in gastrointestinal tract by proteolytic enzyme, polylactide was used to en capsulate the insulin. The insulin release profile from microspheres in vitro and

4、 characteristics after oral administration in vivo were studied.METHODS：Insulin entrapped in polylactide microcapsulated insulin (PLA-MCI) was determined by Follin-phenol method by UV spectrophotometer.The hypo glycemic effects were determined by periodically assaying blood glucose levels in diabeti

5、c rats.RESULTS：In vitro insulin began to release from PLA-MCI since 30 min in 10 mmol.L-1 PBS buffer (pH 7.4) ,it released for 65%80% after 610 hours. The above buffer contained released insulin was injected into diabetic rabbits.It showed similar hypoglycemic profile to insulin.34 unfasting diabeti

6、c rats were gavaged by PLA-MCI (contained insulin 2.5mg).Their peripheral blood glucose decreased to (-57-21)% of control levers for (84)h.The peak action was in 712 hours after oral administration.The hy poglycemic effects were positively related to the doses of PLA-MCI.CONCLUSION：PLA-MCI kept the

7、hypoglycemic effects of native insulin but showed a new pharmacologic model.KER WORD：insulin，polylactide acid，microcapsulated insulin胰岛素是很多糖尿病人须终生注射的药物，但每日多次皮下注射给病人带来很大的痛苦与不便。近年来人们对新的胰岛素给药途径进行了多种尝试：直肠、鼻粘膜、眼、肺泡膜给药，透皮给药及口服给药等。其中以口服最理想，口服后门静脉内胰岛素浓度较高，符合生理状态下胰岛素分泌模式。但胰岛素直接口服可在肠道被蛋白酶迅速降解，变性失活。很多研究采用如脂质体、

8、高分子化合物作为载体帮助胰岛素经肠道吸收入血已获得程度不等的降血糖效果12。我们采用了可在体内降解并完全代谢的生物相容性高分子聚合物聚丙交酯研制了胰岛素口服型微囊，进行了体内外的初步研究，结果如下。1材料和方法1.1聚丙交酯胰岛素微囊（PLA-MCI）的制作和特点1.1.1材料聚丙交酯(中国科学院化学所合成3)；胰岛素粉剂(Sigma公司)；Span 80(中国医药公司北京采购供应站)；二氯甲烷(北京化工厂 )。1.1.2方法将胰岛素10 mg溶于10 mmol.L-1 NaO H（pH10）0.5 ml中，加入聚丙交酯（PLA，相对分子质量10000）250 mg，乳化剂Span80（0 .

9、05% 5ml）及二氯甲烷5 ml的混合物中，超声震荡（50 W）下形成PLA/胰岛素微粒乳液（W/ O），再倒入快速搅拌（2000 r.min-1）中的1%明胶液（含0.05% Span80）100ml中，形成了包裹PLA的胰岛素微囊（W/O/W）。经离心、漂洗、冷冻干燥制成PLA-MCI干粉。其中胰岛素含量为0.040.11 mg PLA。1.1.3PLA-MCI的物理特点用扫描电镜（日立5530型，日本）观察，PLA-MCI呈中空的小球形，表面光滑完整平均直径25 m,壁厚300400 nm（ 1）。1扫描电镜下观察单个PLA-MCI的形态(16000) 1.2PLA-MCI体外释药实验

10、根据蛋白质中含苯环氨基酸能与Folin-酚络合生成蓝色化合物的原理，用分光光度计可测定蛋白质含量。而PLA-MCI中只有胰岛素分子含苯环氨基酸，故采用Folin-酚法研究PLA- MCI的体外释药。以751G型分光光度仪（上海分析仪器厂）在波长500 nm测定。本方法敏感度为1 u/ml。在(371)时PLA-MCI 在10 mmol.L-1，pH7.4磷酸盐缓冲液环境中，测定不同时间内胰岛素含量，观察其体外释药情况。1.3动物体内试验全部实验均采用四氧嘧啶糖尿病大鼠及兔（四氧嘧啶购自Sigma，大鼠及兔分别给以150，18 0mg.kg-1，ip.）血糖?16.7 mmol.L-1至少3 d

11、。血糖测定采用快速血糖测定仪（One touch II，美国）。1.3.1消化道不同部位胰岛素直接给药实验为观察胰岛素分子是否可通过消化道粘膜吸收，将大鼠麻醉后开腹直视下直接将胰岛素溶液注入消化道不同部位，观察血糖变化。四氧嘧啶糖尿病大鼠17只，非空腹状态下以2%戊巴比妥钠36 mg.kg -1 ip，颈静脉预先留置肝素化导管以备抽血。分别经管饲口服（n=7，不开腹），注入回肠（n=5），升结肠内（n=4）胰岛素混悬液2ml（含胰岛素2.5mg溶于2%胆酸钠2ml，pH7 .8），并以向回肠内注入等量的生理盐水作为开腹手术(对照1,n=2)，分别于给药前，给药后10，30 min及以后每小时测

12、颈静脉血血糖，直至血糖自然恢复至给药前水平，每次抽血后立即从导管内补入等量生理盐水。当血糖2.0 mmol.L-1时立即iv给予25% GS 5 ml。为排除多次测血糖对大鼠正常进食的影响，我们还对6只糖尿病大鼠（对照2）进行了同期无麻醉不开腹不给药的饥饿实验（可饮水），同上法观察血糖变化。1.3.2PLA-MCI中胰岛素活性测定为了解微囊制备过程是否会破坏胰岛素活性，在室温下将PLA-MCI溶于水中自然释药24 h，离心，取上清液用Folin -酚法测定胰岛素含量，给4只糖尿病兔im该上清液观察血糖变化，并以含等量胰岛素（上海生物制药厂）药液给2只糖尿病兔肌注，比较胰岛素活性的变化。1.3.

13、3口服PLA-MCI的动物体内实验34只糖尿病大鼠非空腹、无麻醉于清晨管饲PLA-MCI 混悬液23 ml（其中含胰岛素2.5mg)。于服药前、服药后30 min、每小时至18 h测尾静脉血血糖，直至血糖恢复至对照水平。如18 h血糖仍未升高至对照水平，则每24 h测血糖直至48 h。当血糖2.0 mmol.L-1ip 给以25% GS 5m l。实验过程中动物可自由进食、水。2结果2.1PLA-MCI体外释药实验当PLA微球直径分别为1.52，25，1020 m时，药物包裹率分别为82%，93%，44%，载药率为10%。以下研究均采用直径25 m微球。 37时直径为25 m的PLA-MCI在

14、PBS （pH7.4）中30 min开始释药，610 h为释药高峰，36 h后达释放平台，持续释放可达 108 h。该微囊在上述缓冲液中于2，6，8，10 h时胰岛素已分别释放出?38%，58%，65%，74%（2）。2PLA-MCI于(371)时，在10 mmol.L -1磷酸盐缓冲液中15 h内累积释放胰岛素的情况2.2体内实验2.2.1不同消化道部位直接注入胰岛素实验，结果见表1。以回肠部位胰岛素注入后血糖下降率最明显，并与经口、结肠及2种对照实验的血糖变化相比呈现统计学上显著差异。提示胰岛素分子可经小肠壁直接吸收并保持其生物活性。由于口服后胰岛素先进入胃，胃的酸性环境及胃、十二指肠段含

15、有的高浓度消化酶可使胰岛素变性失活，故直接口服基本不能降低血糖，口服后血糖的变化可能是经小肠段吸收后引起的。2.2.2PLA-MCI中胰岛素活性测定4只四氧嘧啶糖尿病兔im含 8u胰岛素的PLA-MCI体外释放上清液后，平均血糖下降(90.24.4)%（n=4），而注射含8u的药用胰岛素溶液的糖尿病兔平均血糖下降(81.09.9)%（n=2）（P0.05），且起效时间相似，高峰作用均在35 h。提示PLA-MCI制作过程未改变胰岛素生物活性。2.3口服PLA-MCI的体内实验34只糖尿病大鼠口服PLA-MCI（含胰岛素?2.5 mg）后23只（占68%）血糖下降(68.5? 11.7)%，7只

16、（占21%）血糖下降(39.76.6)%，还有4只（占12%）血糖下降(20.08.3)% 。全组34只大鼠平均最大血糖变化为(-57-21)%。口服PLA-MCI平均起效时间13 h ，峰作用时间在712 h，持续作用(84) h，最长可达18 h。个别大鼠体内还出现多个峰效应，可能与胰岛素不断从微囊中释放有关。为观察口服不同剂量PLA-MCI对血糖的影响， 32只糖尿病大鼠随机分为4组，每组分别管饲含胰岛素1.2，1.8，2.2，3 mg的PLA-MCI（实验中大鼠可自由进食、水）。结果显示平均血糖下降为(28.07.7)%，(36.017.0)%，(54 .014.0)%及(78.021

17、.2)%（每组n=8），PLA-MCI剂量与血糖的下降呈正相关。胰岛素直接给药对血糖的影响见表1。表1胰岛素直接给药对血糖的影响给药部位例数/n血糖下降率/%口服742.224.6回肠585.017.41)结肠434.824.62)对照120对照2636.015.0注：对照1为向回肠内注入2ml生理盐水，对照2为同期饥饿实验；与口服比P0.0 2，与对照2比P0.001；2)与回肠内注射比P0.05 3讨论口服胰岛素是目前多种给药方法中最理想、最简便的。但胃及十二指肠内的大量蛋白水解酶可迅速使胰岛素变性失活，过去公认胰岛素口服是不能降低血糖的。但本实验结果及很多其他研究者均发现胰岛素分子是能透

18、过肠壁吸收入血的，小肠的吸收率最高，结肠与直肠也有较高的吸收率4，并已证实胰岛素分子是通过小肠上皮细胞的转运进入肠内环境，再渗透入毛细血管内皮细胞质膜并进入血循环5。本研究证实经PLA-MCI中释出的胰岛素仍保持其生物活性，等量的微囊中释放的胰岛素与药用胰岛素可在动物体内产生相似的药理作用及几乎相同的降血糖效果。但由于PLA-MCI的缓慢释放，口服后作用模式发生变化，平均高峰作用时间在(712) h，持续作用时间(84) h，平均降血糖可达(5721 )%，并表现较大的个体差异。这可能与动物未禁食，实验前体重、血糖及摄食、水情况不同有关。因为进食与否及进液体或固体食物的不同会引起不同的肠蠕动波

19、及食物的转运时间，空腹可能会使PLA-MCI转运与吸收加快，降血糖效应提前或增强，大量饮水可能有利于胰岛素分子扩散，此外血糖的高低可直接影响胃肠运动6。近年来，PLA用于临床的缝合线，骨钉及皮下埋置的缓释疫苗等的生物相容性高分子聚合物。其基本组成单位是乳酸，通过酯键聚合成相对分子质量不等的聚合物。在酸、碱、微生物存在时互联的酯键发生断裂，最终降解为小分子乳酸。其降解速度非常缓慢，在体内达数月之久，降解速率与分子量成反比。本研究中采用相对分子质量10000的PLA制成直径为25 m的中空微球，壁厚300 nm，表面光滑具半透膜特性。水进入微囊后直径30 nm的胰岛素分子主要经稀释透过半透膜的微小

20、孔隙（100 nm）向外扩散，从而保护胰岛素避免在胃、十二指肠等含有大量消化酶的部位被降解7。口服PLA-MCI降糖高峰在712 h，正是其通过胃、十二指肠进入小肠后的时间，较体外释药延迟12 h，可能与胰岛素从微囊中释放，透过肠壁进入血循环再发挥降血糖效应需要一段时间有关。其持续降血糖时间多短于18 h，显著短于目前报告的其它高分子聚合物包囊的胰岛素降血糖时间（620 d），且降血糖的幅度较大，有利于控制餐后的高血糖。关于PLA微球在体内的代谢，我们测定了糖尿病兔口服PLA-MCI后每小时血乳酸值，观察28 h，并未发现血乳酸水平的增高（2.51.2) mmol.L-1，提示PLA可能主要最

21、终随粪便排出而不会进入血液。这完全不同于目前报道的其它高分子聚合物毫微囊胰岛素可进入血液产生有毒的代谢终产物8。因为PLA的终产物乳酸也是肠道内细菌的代谢产物，即使有少量进入血液，也可经生物代谢排出，故PLA-MCI具有良好的安全性，可能是一个有希望的口服型胰岛素制剂。作者单位：马学毅(北京解放军304医院内分泌科100037)潘国敏(北京解放军304医院内分泌科100037)胡景胜(北京解放军304医院内分泌科100037)贾军宏(北京解放军304医院内分泌科100037)吕泽(北京中国科学院化学所100080)王身国(北京中国科学院化学所100080)参考文献：1Dange C, Mick

22、el C, Aprahamian M，et al.New approach for oral administration of insulin with polyalkylcyanoacrylate na nocapsules as drug carrier.Diabetes,1988, 37(2): 246.2Iwange K, Ono S, Narioka K et al.Oral delivery of insulin by using surface coating liposome improvement of stability of insulin in GI tract.Int J Pharm,1997, 157(1): 73.3Leenslag JW, Pennings AJ. Synthesis of hig h molecular-weight poly (L-lactide) initiated with tin 2-ethylhexanoate. Mak romol Chem, 1987, 188:1809.4Mickel C, Aprahamian M, Defontaine L et al.The effect of site of administration in the gastrointestinal tract on the