大鼠心肌缺血再灌注损伤及中性粒细胞浸润与一氧化氮心肌保护作用

1、大鼠心肌缺血再灌注损伤及中性粒细胞浸润与一氧化氮心肌保护作用的研究        【摘要】     目的 中性粒细胞（Neu）心肌浸润是心肌缺血再灌注（I/R）损伤的重要机制之一。本实验通过在大鼠中建立心肌I/R模型，研究I/R过程中心肌损伤与中性粒细胞浸润的关系，并通过左型精氨酸（L-Arg）干预，探讨一氧化氮（）对中性粒细胞浸润的影响及其在心肌I/R损伤中的保护作用。方法 实验分对照（CON）组、LArg处理组。每组又分缺血前、缺血40 min、再灌1 h、再灌

2、3h和再灌6 h 5个时间点，分别测定各组各时间点血清肌酸磷酸激酶（CPK）及心肌匀浆丙二醛（MDA）值，并观察心肌组织病理学的改变。结果 （1）CPK及心肌匀浆MDA测定结果：再灌注后各时相血清CPK及肌匀浆MDA含量较缺血前明显上升，再灌注3h后达到高峰。LArg组中再灌注后各时相点血清CPK及肌匀浆MDA明显低于CON组（P0.05）。（2）HE染色结果：缺血前心肌细胞完整，边界清楚，心肌横纹清晰。CON组：再灌后1h出现Neu心肌浸润，再灌3 h Neu心肌浸润更明显， 累及心肌全层，伴有局灶心肌坏死；再灌6 h后Neu浸润尤甚，大片心肌坏死，并可见小血管内Neu聚集现象。LArg组：

3、再灌注后Neu心肌浸润明显减少，再灌6 h心肌坏死灶较CON组明显缩小。结论 （1）心肌I/R过程中有大量Neu心肌浸润，与心肌损伤密切。（2）LArg能抑制Neu心肌浸润，具有心肌保护作用。     【关键词】  中性粒细胞； 缺血再灌注； 一氧化氮； 精氨酸； 心肌保护    The Experimental Study on the Role of Neutrophil Infiltration and the Myocardial Protection of the   Nit

4、ric Oxide During Ischemia Reperfusion in RatsWu Danning，Jia Guoliang，Ma Yinyan，Li Wei(Department of Cardiology，the 117th Hospital.of  PLA,Hangzhou 310013,China)Abstract： Objective  The neutrophil infiltration is one of the reasons which lead to the myocardial ischemic reperfusion (I/R) inj

5、ury. The study aimed at investigating the changes between myocardic injury and neutrophil infiltration during I/R, and inquiring into the mechanisms of myocardial protection against I/R injury by intravenous infusion of Larginine(LArg) in ratty myocardial I/R model. Methods  The rats were divid

6、ed into 2 groups, including the Control and LArg infusion group, each with pre-ischemia , postischemia  40mins, reperfusion for 1h ,3 hrs and 6hrs  subunits. The changes of serum CPK、myocardial MDA、  histopathology were examined .Results  Result  were showed that the levels

7、of serum CPK and myocardial MDA  increased  after reperfusion, and reached the highest at 3hrs followed reperfusion, the content in the LArg groups were significantly lower(P0.05 Vs CON) and that histopathologically the myocardial  neutrophil  infiltration appeared at 1h followed

8、 reperfusion, and increased with the continue of the reperfusion , accompanied by the myocyte  necrosis in the control  group. With the LArg infusion intraveneously following ischemia, decrease of neutrophil  infiltration and myocyte  necrosis were showed in rats .Conclusion 

9、; (1)The myocardial neutrophil infiltration indicates neutrophials participate in impairing the myocardium during I/R; （2）The LArg prevents the neutrophils from myocardial  infiltration ,and ameliorate the ischemic-reperfusion injury.Key  words： neutrophill ;  ischemia reperfusion; ni

10、tric oxide; Largnine; myocardium protection随着静脉溶栓及经皮腔内球囊成形术治疗急性心肌梗死的开展，缺血再灌注损伤的研究受到广泛重视。心肌缺血再灌注损伤是一种复杂的病理生理变化，其包括再灌注心律失常、心肌晕厥、再灌注心肌死亡及无复流现象等，中性粒细胞（Neu）心肌浸润与此密切相关。一氧化氮(NO)具有舒张血管、调节血压、抑制血小板聚集、调节细胞增殖、保护内皮细胞等多种功能；病理状态下，NO还与多种心血管疾病的病理损伤及修复有关。本研究旨在在SD大鼠中建立缺血再灌注（I/R）模型，通过心肌病理学检查、血清CPK及肌匀浆丙二醛(MDA)测定分析，以及左型精

11、氨酸(L-Arg)干预作用，探讨I/R过程中心肌损伤与Neu心肌浸润的关系，及NO对Neu心肌浸润的作用。1  材料与方法11  动物模型的建立 (1) 动物： 健康雄性SD大鼠50只，体质量200250 g，由第四军医大学动物中心提供。(2) 模型制备：以4%戍巴比妥钠（40 mg/kg）经腹腔麻醉成功后，行气管切开术，接人工呼吸机（频率60次/min， 潮气量30 ml）。分离颈浅静脉及颈总动脉，分别行动、静脉插管术。静脉插管接微泵注射器，注射生理盐水2 ml/h。动脉插管接八导生理仪之载波放大器及血压表，记录大鼠动脉压（收缩压SBP，舒张压DBP及平均压MB

12、P）。心电图导联线与大鼠四肢相连接入心电图放大器，记录标准导联心电图。于大鼠胸骨左缘24肋处，逐层打开皮肤、肌肉及肋骨，暴露心脏，分离心包膜，用眼科小圆针在前降支起始后0.20.3 cm处穿一结扎线，再将结扎线两头穿过23 cm的塑料管备用。手术完成后稳定10 min。(3)进行缺血再灌注模型的建立：将一小塑料管顺结扎线滑行，收紧结扎线，以止血钳夹紧塑料管固定，造成缺血。放松止血钳，取出小塑料管，形成再灌注。缺血时，心肌局部变暗，活动减弱，动脉平均血压下降（10 mmHg），心电图STT呈明显上抬或单向曲线。再灌注时，心肌局部搏动恢复，即刻动脉平均压恢复至缺血前，心电图STT段回落1/2以上。

13、12  实验方案     动物分组：50只大鼠随机分为对照组、LArg干预组。每组随机又分为缺血前、缺血40 min后、再灌注1 h、再灌注3 h及再灌注6 h 5个时相点。每组25只大鼠，每个时相点5只。对照组：即模型组。建立缺血-再灌注模型，实验过程中用生理盐水静脉维持。于各不同时间点于右心房抽取静脉血；用10%氯化钾静脉内注射处死动物，取出心脏后，分别留取缺血区及非缺血区心肌组织。  LArg干预组：于缺血后即给予LArg（40 mg/kg）静脉一次性注射，以后用生理盐水维持（2 ml/h）。处死动物及留取标本同对照组

14、。13  观察指标131  心肌酶测定 抽取右房血2 ml，放置40 min后，以1 000 r/min离心510 min，留取血清，封口，置-80低温冰箱冻存，集中送检。用酶动力学法，在日立7150全自动生化分析仪上测定（试剂盒CPKNAC系澳大利亚TRACE公司产品），单位IU/L。132  心肌MDA测定 测定试剂盒由暨南大学病理生理教研室提供，并依照其提供的方法进行测定。取缺血再灌注区的心肌组织试纸吸除水分称重后，置于研磨器内，每克组织加生理盐水4 ml，研磨成心肌组织匀浆，然后以3 000 r/min的速度离心15 min，吸取上清液

15、置管封存冷冻。测定方法按试剂盒说明进行，MDA的单位：nmol/g（每克湿质量组织MDA的含量）。133  心肌冰冻切片的制备 在保温瓶中预先装满液氮，然后将盛有异戍烷（进口分装）的烧杯放入液氮中，用长镊不断搅动，直至异戍烷出现一层白膜（此时温度达155160），迅速将新鲜心肌组织标本投入异戍烷，不停搅动2030 s后，取出后用OCT包埋剂包埋，置20恒温冰冻箱切片机进行切片，切片厚度为5m。切片后迅速用95%的乙醇固定1015 min，置20的冰箱中保存备用。134  HE染色 置心肌切片标本于苏木精染液中34 min浸染，取出洗涤后置于伊红染液中12

16、 min，洗涤后依次于80%，90%，95%，100%的乙醇中脱水后35 min，二甲苯中透明3 min。用中性树胶封片，备检。14  统计学处理     应用第四军医大学统计学教研室提供的SPLM统计软件包。数据结果以均数±标准差(±s)表示。两组均数间比较用t检验, 多组均数间用方差分析。P0.05为相差显著，P0.01为相差非常显著。2  结果2.1  心肌CPK变化 再灌注后各时相点血清CPK较缺血前均有不同的增高, 再灌注3 h达高峰。L Arg组再灌注后各时相点血清CPK分

17、别低于CON组(P0.05)。（表1）表1  大鼠心肌缺血再灌注血清中CPK改变(略) 22  心肌匀浆MDA变化 再灌注后各时相点心肌匀浆MDA的含量均有不同程度的上升, 再灌注3 h为高峰。LArg组再灌注后各时相点心肌匀浆MDA分别低于CON组(P0.05) 。（表2）表2  大鼠心肌缺血-再灌注心肌匀浆中MDA变化(略)    23  病理H-E染色病理检查结果:  缺血前正常心肌组织中心肌纤维排列整齐， 细胞边界完整，心肌横纹清晰。再灌注后1 h,，心肌中出现Neu浸润，位于

18、心内膜下，心肌组织中未见明显坏死灶。再灌注后3 h，Neu浸润明显，心内膜、心肌层及心外膜均可见，心肌横纹消失，出现局灶性心肌坏死；再灌注6 h后，大量心肌细胞坏死伴Neu浸润，以心外膜明显，并可见小血管有大量Neu聚集。LArg干预组：大鼠心肌组织再灌注后1 h无明显Neu心肌浸润，再灌注6 h仅少量Neu心肌浸润，心肌坏死灶也明显减少。3  讨论   本实验结果显示：I/R过程中，随着Neu心肌浸润的加重，血清中CPK及心肌匀浆中MDA也明显升高，心肌组织中形成的坏死灶也明显增加。Larg干预后，Neu心肌浸润明显减轻，血清中CPK及心肌匀浆中MDA

19、也明显降低(P0.05)，病理心肌坏死也明显减少。心肌I/R过程中有大量Neu心肌浸润，与心肌损伤密切；LArg能抑制Neu心肌浸润，具有心肌保护作用。国外也有类似报道1。 目前认为I/R损伤与心肌内氧自由基大量产生、Neu浸润及心肌细胞内钙离子超载有关，其中Neu心肌浸润具有重要作用。Neu不仅能产生大量氧自由基，氧化胞膜及各种蛋白质；还能释放各种炎性介质及溶酶体酶等有害物质直接损伤细胞。另外,微血管中有大量的Nue浸润可堵塞血管，产生再灌注的 “无复流”现象，加重了I/R损伤。 因此Neu心肌浸润在I/R损伤具有重要的病理意义，阻断Neu的心肌浸润有助于减轻I/R损伤。LArg为一氧化氮合

20、酶（NOS）的底物，血管内皮细胞中 LArg和O2在NOS的催化下，由多种辅助因子传递电子，生成NO和瓜氨酸3。NO具有舒张血管、调节血压；抑制血小板聚集、防止血栓；保护细胞及调节细胞增殖的功能4,5。NO还具有抑制氧自由基产生的作用6。缺血再灌注损伤会导致内皮功能障碍，内源性NO生成减少7。用LArg进行干预后，增加了NO合成的底物，促进了内皮合成内源性NO，同时抑制内皮各种炎性因子的产生及氧自由基的合成，减少其对内皮的损伤8；近年来研究发现Neu浸润心肌与细胞间粘附分子ICAM1与CD11/CD18密切相关 9。LArg 干预后可能抑制了内皮细胞及Neu 的粘附分子的表达，从而减少了Neu

21、的心肌浸润10，发挥其心肌保护作用。    【参考文献】  1Sato H,Zhao Z Q,Jordan J E,et al.Basal nitric oxide exprsses endogenous cardioprotection during reperfution by inhibition of neutroopi 1mediated damage after surgical revascularizationJ.J Throac Cardiovasc Surg,1997,113:399.2 Ambrioso G, Chiari

22、ello M. Myocardial reperfusion injury :mechanism and management: a reviewJ. Am J Med,1991,91（supply 3c）：86S.3 Bredt D S, Ferris C D, snyder S H. Nitric oxide synthase regulatory sitesJ. J Biol Chem,1992,267:10976.4 Vallance P, Collier J, Moncada S. Effects of endothelium drived nitric oxide on perip

23、heral arterior tone in manJ. Lancet,1989,2:997.5 Grarg U C, Hassid A: Nitric oxide generating vasodilators and 8-bromo-cyclic GMP inhibit mitogenesis and proliferation of culture rat vascular smooth muscle cellsJ. FASEBJ,1991,5:A1608.6 Rubanyi G M, Ho E H, Cantor EH, et al. Cytoprotective function of nitric oxide: inactivation of superoxide radicals produced by human leukocytesJ. Biochem Biophys Res Communi,1991,181:1392.7 Lefer A M. Attenuation of myocardial ischem