细胞总蛋白的提取及裂解液

1、For personal use only in study and research; not for commercial use细胞总蛋白的提取及裂解液一悬浮细胞计数 107 重悬于 0.5mlPBS（0.01M） 中，加入饱和浓度一抗 （1/10） 或（10ug/ml） 4 C 15-30min 后，短暂离心 4000 转 X3 分，用 PBS 0.4-0.5ml 重悬（室 温），加入饱和浓度二抗（1/100 ）或（20ug/ml）,迅速置于37 C水浴中2-5分后（迅速加入终止液 0.5ml （冷pbs中含有400uM Na3VO4,5mM EDTA,10mM NaF ） ,离心40

2、00转X3分，弃上清置于冰浴中，加入裂解液0.2-0.3ml（裂解浓度108/ml ？ ）吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育 30 分钟后加入 10ul 浓度为 10mg/ml 的PMSF储存液，冰点孵育 30分钟。4度离心15000g 20min。上清液即为全部细 胞溶解成分。二裂解缓冲液：50mM Tris-HCl pH7.6 或 20mM Hepes pH7.4150-300mM NaCl1（w/w）NP-40 （0.5%Triton-X100）5mM EDTA （现加 1ml 加 10ul）临用前加入蛋白酶抑制剂：Na3VO4钒酸钠 1mM （75mM 13.3ul/ml）（用 0.2mo

3、l/L 储存液配制）PMSF 苯甲酰氟 1mM （10mg/ml PMSF 用量：10ul/ml） 或 10-20ug/ml Soybean Trypsin inhibitor （加 10-20ul）Aprotinin 抑肽酶 10ug/ml （ 10ul/ml ）（Leupeptin 亮肽素 10ug/ml 未加 ） Western blotting三给你介绍一个裂解液：50mM Tris-HCl （PH8.0）缓冲液，含：NaCl 150mM叠氮钠 0.02%SDS 0.1%NP-40 1%PMSF 100ug/ml （使用前临时加入） （10mg/ml PMSF 用量： 10ul/ml）

4、 尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用 6xSDS 上样 buffer。四我的样品蛋白是这样制备的：1 将与腺病毒转染液共培养2 4小时的细胞消化下来2 .离心收集细胞3 向离心管里加入4 0微升1XPBS缓冲液，随后再加入4 0微升2XLamilybuffer （由 tris 碱和 SDS 组成）裂解细胞4将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心.5 测定蛋白浓度，加样电泳我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白胶的浓度应该没 问题。五碧云天公司技术支持Western 及 IP 细胞裂解液的主要成分为 20mM Tris（pH 7.5） , 150mM NaCI ,

5、 1% Triton X-100，以及焦磷酸钠，-（glycerophosphate, EDTA , Na3VO4 , leupeptin 等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。（-20C保存，一年有效。）如果是贴壁细胞，按照 6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量 的1/20）加入裂解液。六. 军科院技术支持裂解液（50mmol/L Tris?HCl pH8.0 , 150mmol/L NaCl , 1%TritonX 100, 100ug/mlPMSF）:1mol/L Tris?HCl （ pH8.0）2.5mlNaCl 0.438gTrit on

6、X 100 0.5ml蒸馏水至50ml混匀后，4C保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml （0.87ml裂解液加入 1.74mg/ml PMSF50（il）。七. 操作方法：蛋白样品制备：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、 每瓶细胞加 3ml 4度预冷的PBS （ 0.01M pH7.27.3） o平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、 按1ml裂解液加10 ul PM

7、SF （ 100mM ）,摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无 结晶时才可与裂解液混合。）4、 每瓶细胞加400 ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解 30min，为使细胞充分裂 解培养瓶要经常来回摇动。5、 裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于4度下12000rpm 离心5min。（提前开离心机预冷）7、 将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于一20度保存。仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and researc

8、h; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasommecteaiesis cto员bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ymrnflCH6yHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 员 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 员 ex.仅供个人用于学习、研究；不得用于商业用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l ' e tude et la recherche uniquementa des fins personn