低温条件下相关关键酶活性对棉纤维比强度形成的影响

1、低温条件下相关关键酶活性对棉纤维比强度形成的影响卞海云，王友华，陈兵林，束红梅，周治国（南京农业大学农学院/农业部作物生长调控重点开放实验室，南京 210095）摘要：【目的】研究低温对纤维比强度形成的影响。【方法】通过设置大田分期播种试验，使相同果枝部位棉铃可以处于不同的温度条件下发育，研究低温对棉纤维发育关键酶活性及相关基因表达的影响。【结果】低温影响纤维素的累积速率并最终影响纤维比强度的形成，其原因是在不同水平上影响了纤维发育关键酶的活性。在生化水平上，低温（铃龄050 d日均温23.0，铃龄2550 d日均温21.0）提高了纤维中-1,3-葡聚糖酶的活性、降低了蔗糖合成酶的活性，且前者

2、对温度更为敏感。在基因表达水平上，低温使Expansin、蔗糖合成酶基因的表达量增加，-1,3-葡聚糖酶基因的表达与此相反，低温下Expansin到达表达峰值时间推后且维持高表达的时间延长，低温可导致15 d铃龄纤维-1,3-葡聚糖酶基因表达量显著降低，而蔗糖合成酶基因表达量显著升高。【结论】在纤维品质形成上，低温导致棉纤维伸长期及伸长高峰推后，低温下纤维素累积量、纤维比强度的变化特征与纤维蔗糖合成酶活性及-1,3-葡聚糖酶基因表达的变化特征高度一致，与-1,3-葡聚糖酶活性及蔗糖合成酶基因表达受低温影响的规律相反。关键词：低温；Expansin；-1,3-葡聚糖酶；蔗糖合成酶；基因表达；纤维

3、发育；纤维比强度Effects of the Key Enzymes Activity on the Fiber Strength Formation Under Low Temperature ConditionBIAN Hai-yun, WANG You-hua, CHEN Bing-lin, SHU Hong-mei, ZHOU Zhi-guo (College of Agronomy, Nanjing Agricultural University / Key Laboratory of Crop Growth Regulation, Ministry of Agriculture,

4、Nanjing 210095)Abstract: 【Objective】This experiment was carried out to study the effects of low temperature on cotton fiber strength development.【Method】The effects of low temperature on the dynamics of several key enzymes activity and the gene expression pattern were studied by setting different se

5、eding times, thus the fiber developing process can be arranged at different temperature conditions.【Result】 The results showed that the dynamics of the enzymes activity and the genes expression were influenced in by low temperature conditions. At the biochemical level, the activity of the -1,3-gluca

6、nase was decreased with the increasing of the temperature while the sucrose synthetase activity behaved oppositely. Evidences also showed that the -1,3-glucanase were much more sensitive to temperature variation than sucrose synthetase. At the gene expression level, the effect of low temperature (me

7、an daily temperature of 0-50 DPA (days post anthesis) and 25-50 DPA was lower than 23.0 and 21.0, respectively) on different genes expression was quite different. At low temperature, the expression of the -1,3-glucanase gene was remarkably inhibited in the days around the 15 DPA and the high express

8、ion period of the expansin gene was prolonged. For the fiber strength development, the peak of the fiber elongation was prolonged and that was accordant with the variation of the expression pattern of the expansin gene, the -1,3-glucanase and the sucrose synthetase gene. 【Conclusion】 The variation o

9、f the cellulose deposition and the textile processing was highly accordant with the changes of the -1,3-glucanase gene expression pattern and variation of the dynamics of sucrose synthetase activity, while it was absolutely opposite to the changes of the sucrose synthetase gene expression pattern an

10、d variation of the dynamics of -1,3-glucanase activity. Key words: Low temperature; Expansin; -1,3-glucanase; Sucrose synthetase; Gene expression; Fiber development; Fiber strength0 引言【研究意义】近年来，随着棉花多熟制种植面积不断扩大，棉花秋桃、晚秋桃在棉花产量中的比重不断增加，棉花属喜温型作物，低温严重影响秋桃、晚秋桃纤维品质的形成1,2，而纤维比强度又是纤维品质的重要指标，因此低温对棉纤维比强度形成的影响已引

11、起人们的高度重视。【前人研究进展】成熟棉纤维90%以上的成分是纤维素，纤维比强度与纤维素的累积、纤维伸长和加厚过程中相关酶的作用密切相关。目前的研究表明，在参与纤维发育的众多已知调节因子中，膨胀素（Expansin）35、-1,3-葡聚糖酶6、蔗糖合成酶7,8与纤维的发育关系更为密切：Expansin在纤维细胞伸长过程与胞壁松弛过程中起作用，它在细胞壁中的纤维素微纤丝和基质多糖交叉处，以一种可逆（非水解）方式打开限制纤维伸长的纤维素微原纤和纤维素-木葡聚糖间的氢键，促使聚合物滑动并引起细胞壁的伸展，让新近合成的细胞壁原料以可控的方式沉积35，从而促进纤维的伸长和加厚；蔗糖合成酶（sucrose

12、 synthetase，SuSy或SS3）是纤维素合成直接底物尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）合成的关键性酶，质膜上纤维素合成酶复合体与蔗糖合成酶相连并可直接接受由蔗糖合成酶催化产生的UDPG合成纤维素。研究表明，蔗糖合成酶的mRNA水平在整个生长阶段基本保持不变810；尽管-1,3-葡聚糖酶是纤维素生物合成的媒介还没有直接证据，但研究表明在纤维素大量沉积时，需要-1,3-葡聚糖酶的高活性和高表达11。棉纤维是种皮细胞壁突起形成的，关于低温条件下棉纤维比强度形成的研究，大多停留在纤维物理参数及相关生化指标的测定水平12, 13，其中蒋光华研究认为棉纤维加厚发育期（铃龄2550 d）24.0左右的日

13、均温是高强纤维形成的最佳温度，低于21.0时即对棉纤维加厚发育相关酶活性产生明显影响，纤维比强度降低，当温度降到15.0 左右时，棉纤维不能正常发育13。【本研究切入点】但在分子水平上针对上述纤维发育关键酶活性及其基因表达在棉花上的相关研究、以及对温度等生态因子的响应未见报道，而这对深入了解纤维比强度形成机制、明确高质纤维棉花品种的分子育种方向、并在农艺上采取合理有效的措施稳定和提高纤维品质都具有重要意义。【拟解决的关键问题】本研究拟通过设置不同播期试验，使棉纤维发育过程处于不同的温度条件下，同时在生化水平及基因表达水平上研究低温条件下棉纤维发育关键酶的动态变化特征，并结合纤维素累积及纤维比强

14、度的特征分析，探讨棉花纤维比强度形成的生理和分子机制，为棉花高强纤维形成的分子育种和生理调控提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验设计试验于2004年在南京农业大学卫岗试验站进行，采用盆栽方法。供试土壤为黄棕壤土，土壤有机质含量15.3 gkg-1，全氮含量0.8 gkg-1，速效磷含量39.97 mgkg-1，速效钾含量237.5 mgkg-1。供试品种为美棉33B（Gossypium hirsutum L.）。为形成棉铃发育期的低温条件，试验设置2个播期：5月11日（T1）和6月16日（T2），每个播期40盆。待棉花开花后，分别对棉花23、68、1112果枝1、2果节的当日白花挂牌标记，

15、分别取铃龄7、15、25 d的棉铃810个，将纤维和种子分开，纤维液氮冷冻后，一部分保存在-20下，一部分保存在-70下备用。棉花按常规高产栽培要求进行管理，开花后50 d收获处理棉铃。试验所用气象资料来自南京气象局，棉纤维不同发育阶段日均温见表1。1.2 试验方法用瑞典Tecator纤维系列仪测定棉花纤维素含量。用流水冲洗法测定未成熟纤维长度17。纤维比强度的测定是混匀纤维样品后用棉花纤维引伸器制成棉条，用国产Y162A型束纤维强力机测定3.2 mm隔距比强度，测6次重复，平均值作为试样代表值，并用中国纤维检验局标准棉样修正。用果糖和UDPG比色法测定蔗糖合成酶活性14，用昆布多糖比色法测定

16、-1,3-葡聚糖酶活性15，-1,3-葡聚糖酶一个酶活力单位（U）定义为每秒从还原昆布多糖中释放出1 nmol葡萄糖所需的酶量，酶活性以每克鲜样重的酶活力单位表示。用CTAB/酸酚法提取总RNA16。以梯度总RNA量及梯度循环数确定可区分表达强度差异的最佳PCR循环数。等量总RNA进行RT-PCR，反应条件：42 1 h；94 5 min；94 30 s，退火温度 30 s，72 30 s，合适循环数；72 5 min。所用引物、退火温度及循环数见表2。表1 棉纤维不同发育阶段日均温（）Table 1 Mean daily temperature at different stages of

17、cotton fiber development播期Seeding time果枝部位Fruiting branch position日均温Mean daily temperature0-25 DPA25-50 DPA0-50 DPA5月11日 (T1)11-MayL-FB30.425.227.8M-FB28.824.626.7U-FB25.120.023.26月16日 (T2)16-JunL-FB25.120.023.2M-FB23.118.021.1U-FB21.516.719.6DPA：花后天数Days post anthesis；L-FB: 下部果枝铃Bolls setting on t

18、he lower fruiting branches；M-FB: 中部果枝铃 Bolls setting on the middle fruiting branches；U-FB：上部果枝铃 Bolls setting on the upper fruiting branches表2 试验所用的PCR引物、退火温度及循环数Table 2 Primers, Tm and Cycles of PCR used in the experiment基因及序列号Gene and accession number引物Primer退火温度Tm ()循环数Cycles扩增片段长度 (bp)Length of

19、amplified DNAExpansin（AF043284）forward：5-AGTCGAACCATAACCGTGACAGCC-3reverse：5-CCCAATTTCTGGACATAGGTAGCC-35623328-1,3-glucanase（D88416）forward：5-GAGGACATACAAAGCCTCGCA-3reverse：5-AGGTTGTAGTATTCCAAGCCT-35833455Sucrose（U73588）forward：5-AGAACCCAAAGTTGCGTGAG-3reverse：5-ACCGTTACAGGTTGCGAATG-35830305EF1（AJ223

20、969）forward：5-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3reverse：5-CCACCAATCTTGTACACATGC-35526496RT-PCR所用各种生化酶均购自美国Promega公司，RNA提取过程中所需化学试剂均为分析纯。2 结果与分析2.1 低温对棉纤维加厚发育关键酶活性变化的影响在棉株的下部和中部果枝，T1播期铃龄050 d日均温（用T0-50d表示，下同）高于26，纤维加厚发育期，即花后2550 d（用T25-50d表示）日均温在24左右，处于棉纤维加厚发育的适宜温度13，而T2播期相应部位棉铃T0-50d在2123（T25-50d21），可认为棉纤维加厚发

21、育期处于低温条件下13。从图1看出，T1播期在不同铃龄期的-1,3-葡聚糖酶活性均低于T2播期的相应指标，而蔗糖合成酶活性表现出与-1,3-葡聚糖酶活性相反的变化趋势。在棉株上部果枝，T1、T2播期棉铃T0-50d在1923（T25-50d均低于21，分别为20.0、16.7），棉纤维加厚发育期处于不同的低温条件13，棉纤维中-1,3-葡聚糖酶活性均高于其相应播期的棉株下部和中部果枝铃。T2播期在不同铃龄期的-1,3-葡聚糖酶活性均高于T1播期，而蔗糖合成酶活性的变化趋势则与此相反。低温使-1,3-葡聚糖酶活性显著提高，并且随铃龄增大，酶活性变化率越大。低温导致-1,3-葡聚糖酶活性的大幅度变

22、化说明其比蔗糖合成酶对温度变化更为敏感。2.2 低温对棉纤维加厚发育关键酶基因表达的影响 Expansin（GhExp1） 从图2看出，处于适宜温度条件下时（T1播期），棉纤维加厚发育期棉株下部和中部果枝棉纤维中Expansin的表达量均表现为铃龄15 d显著高于7 d，到铃龄25 d时不能检测到该基因的表达，可能因为此时棉铃处于发育最适期，铃龄15 d时已进入Expansin表达高峰期附近，铃龄25 d已几乎不再表达。处于低温条件下时（T2播期），Expansin表达规律与适宜温度条件下的表达规律有较大差异：上部果枝棉纤维中，Expansin在铃龄7、15和25 d的表达量依次增加；在中部果

23、枝铃中则表现为铃龄15 d时最高，7 d时次之，25 d最少；在下部果枝铃中，铃龄15 d时Expansin的表达量远高于铃龄7图1 低温对棉纤维发育关键酶活性变化的影响Fig. 1 Effect of low temperature on the dynamics of the key enzymes involved in the cotton fiber developmentL-FB：下部果枝铃；M-FB：中部果枝铃；U-FB：上部果枝铃；EF1：参照基因。下同L-FB: Bolls setting on the lower fruiting branches; M-FB: Bolls

24、 setting on the middle fruiting branches; U-FB: Bolls setting on the upper fruiting branches; EF1: a constitutive expression gene in cotton fiber. The same as below图2 低温对棉纤维中Expansin基因表达动态的影响Fig. 2 Effect of low temperature on the expression dynamics of the Expansin gene in the cotton fiberd时，而至铃龄25

25、 d时则已几乎不再表达。综合分析T1、T2播期Expansin的表达量总体变化趋势，表现为随温度降低，Expansin的表达量增加，而且在铃龄15 d左右即纤维伸长与加厚发育的重叠期，低温下Expansin到达表达峰值时间推后并且Expansin维持高表达的时间反而较常温下有所加长。 -1,3-葡聚糖酶 从图3看出，在棉株下部和中部果枝，棉铃纤维加厚发育期处于适宜温度条件（见2.1），铃龄15 d棉纤维中-1,3-葡聚糖酶基因的表达量均显著高于铃龄7 d，铃龄25 d时未能检测到该基因的表达；在低温条件下（见2.1），棉纤维中-1,3- 图3 低温对棉纤维中-1,3葡聚糖酶基因表达动态的影响F

26、ig. 3 Effect of low temperature on the expression dynamics of the -1,3-glucanase gene in the cotton fiber 葡聚糖酶基因的表达量均表现为铃龄25 d15 d7 d。-1,3-葡聚糖酶基因的表达量随温度的降低而降低，这与2.1中关于-1,3-葡聚糖酶活性随温度的降低而升高的结论相反，原因可能是低温条件下大量存在于质外体空间的-1,3-葡聚糖酶的半衰期较长。在棉株上部果枝，T1、T2播期棉铃纤维加厚发育期处于不同的低温条件（见2.1），铃龄725 d内-1,3-葡聚糖酶基因的表达均随着铃龄的增加

27、而增加，不同低温条件下基因表达量的变化趋势相同。进一步分析铃龄15 d时纤维中-1,3-葡聚糖酶基因表达量的变化，同样是随温度降低而降低（图4），不同果枝部位棉铃表现相同趋势。结合相应时期单位鲜重纤维所能提出的总RNA的量（表3），结果同时说明-1,3-葡聚糖酶基因的总表达量在纤维的伸长期基本维持在一个较稳定的水平，但随着纤维细胞生命活动的衰退，其表达量在单个发育中的纤维细胞中所占的比例逐渐上升，此结果进一步说明-1,3-葡聚糖酶在纤维的发育过程中发挥着重要作用。表3 单位鲜重棉纤维中总RNA量的定性比较Table 3 Comparison of the total RNA content p

28、er unit freshweight in cotton fiber处理TreatmentRNA量 Total RNA content7 days15 days25 days常温 Control+-低温 Low temperature+图4 低温对棉纤维蔗糖合成酶基因表达动态的影响Fig. 4 Effect of low temperature on the expression dynamic of the sucrose synthetase gene in the cotton fiber 蔗糖合成酶 从图4看出，在棉株下部和中部的果枝，T1播期棉铃纤维加厚发育期处于适宜温度条件，铃龄

29、7 d纤维中蔗糖合成酶基因的表达量高于15 d，铃龄25 d时未能检测到该基因的表达；而T2播期的相应部位铃则处于低温条件，蔗糖合成酶基因表达量的变化趋势均表现为铃龄7 d15 d25 d；低温下蔗糖合成酶基因的表达量略高于适宜温度条件。在棉株上部果枝，T1、T2播期棉铃纤维加厚发育期处于不同的低温条件（见2.1），蔗糖合成酶基因表达量的变化趋势也表现为铃龄7 d15 d25 d。进一步分析铃龄15 d时纤维中蔗糖合成酶基因表达量的变化，低温导致铃龄15 d时纤维中蔗糖合成酶基因表达量升高，不同果枝部位棉铃表现相同趋势。而在相同的温度条件下，不同果枝部位纤维蔗糖合成酶基因的表达量没有明显差异（

30、图5）。结合相应时期单位鲜重纤维的总RNA含量（表3），上述检测结果表明，蔗糖合成酶基因的转录本在单个纤维细胞中所占的比例呈快速下降趋势。2.3 低温对棉纤维素累积量、纤维日伸长量和棉纤维比强度的影响图5 棉株不同果枝部位棉铃铃龄15 d时纤维中Expansin、-1,3-glucanase及sucrose synthetase基因表达量比较Fig. 5 Comparison of expression of the Expansin, -1,3- glucanase and sucrose synthetase genes in cotton fiber at different fruit

31、ing branches at the 15 d boll age由图6可知，在棉株的上、中、下部果枝，T1播期棉铃纤维素累积量均高于T2播期，随着铃龄的增加，差距越来越大。随着果枝部位的上升，纤维素累积含量受低温的影响逐渐增大，且这种趋势与相应温度条件下的棉纤维的比强度（图7）有很高的相关性。图6 低温对棉纤维素累积的影响Fig. 6 Effect of low temperature on cotton fiber cellulose accumulation以棉株中部果枝棉铃纤维日伸长量为例，分析低温对棉纤维日伸长量的影响。从图8可以看出，纤维加厚发育期处于适宜温度时，棉纤维日伸长量在铃

32、龄14 d左右达到高峰，而低温时棉纤维日伸长量在铃龄17 d左右达到高峰，低温使棉纤维伸长期延长，且伸长高峰推后。棉纤维日伸长速率前期表现为适温高于低温，而后期表现为低温高于适温。低温下棉纤维伸长速率的这种变化与Expansin表达量的变化一致。图7 低温对棉纤维比强度的影响Fig. 7 Effect of low temperature on cotton fiber strength图8 低温对棉株中部果枝铃棉纤维日伸长量的影响Fig. 8 Effect of low temperature on cotton fiber daily elongationof the middle fru

33、iting branches在棉株的上、中、下部果枝，T1播期棉铃纤维比强度均高于T2播期（图7）。随着果枝部位的上升，纤维比强度受低温的影响逐渐增大。3 讨论棉花开花后15 d左右不仅是纤维伸长发育的高峰期，也是纤维加厚发育的关键时期。在铃龄15 d附近，低温与常温条件下各纤维发育关键酶的活性变化及其相应基因表达量的变化最能体现低温对纤维发育及纤维比强度的影响。在纤维主要伸长期（725 d），无论在常温（T0-50d26，T25-50d在24左右）条件下，还是在低温（T0-50d 1923，T25-50d21）条件下，Expansin于15 d左右达到表达高峰，这与纤维的伸长速率呈高度正相关

34、。该结果进一步说明Expansin在纤维细胞的伸长过程中发挥着关键性的作用。结果同时说明，低温条件下，纤维细胞中Expansin的表达到达峰值的时间推后且维持高表达的时间加长，这可能是因为低温下纤维素合成速率显著下降，纤维完成伸长所需的时间加长，细胞自身的反馈促进机制调节Expansin的表达从而使其维持高表达的时间延长。这也在一定程度上进一步缩短了低温下纤维的加厚发育时间并进而降低了低温条件下形成的纤维比强度。中部果枝棉铃的高强度可能也与其纤维伸长发育的快速完成及较长的纤维加厚发育时间相关。随着纤维发育的推移，单位鲜重-1,3-葡聚糖酶的酶活下降，但该酶基因的表达量在整个细胞代谢过程中所占的

35、比例却不断提高，其活性及表达量与纤维的伸长速率高度相关，该结果也在某种程度上说明在纤维伸长发育全过程中，-1,3-葡聚糖酶具有较高的表达量并可能在整个纤维发育过程中都具有很高的活性，是影响纤维发育及比强度形成的重要因子，但其在纤维发育过程中确切作用和详细机制尚有待进一步的深入研究。蔗糖合成酶基因在纤维细胞中表达量随铃龄增加而下降，同时其表达受低温诱导，温度下降，表达量上升，上述结果说明蔗糖合成酶作为纤维发育过程中的重要酶7, 8，其对温度及棉铃生理年龄变化非常敏感。相应低温条件下纤维的累积速率及纤维的比强度显著低于常温条件，而作为纤维素合成底物UDPG的供应者，其在低温及较高铃龄条件下活性的快

36、速降低可能是导致低温下纤维素累积速率下降，进而降低纤维伸长速率和加厚速率，并最终导致纤维比强度极显著下降的重要甚至关键性因素。蔗糖合成酶分为膜结合蔗糖合成酶及溶于胞质的蔗糖合成酶。本研究未能对细胞中两种形式的蔗糖合成酶的活性变化及基因表达进行细分研究，进一步研究可从细胞定位、酶基因编码的多态性等角度将两者分开，分别研究它们在纤维素合成中的表达及活性变化，为进一步阐述棉纤维中纤维素合成机理提供更充分依据。4 结论Expansin在棉纤维细胞中的表达量于铃龄15 d左右达到高峰，但在低温条件下，棉纤维细胞中Expansin的表达到达峰值的时间推后且维持高表达的时间延长；-1,3-葡聚糖酶是影响棉纤

37、维发育及比强度形成的重要因子，该酶的活性及基因表达量与棉纤维伸长速率高度相关；蔗糖合成酶基因在棉纤维细胞中表达量随铃龄增加而下降，作为棉纤维发育过程中的重要酶，其基因表达量对温度及铃龄变化非常敏感，温度下降，表达量上升，蔗糖合成酶活性的下降可能是导致低温下棉纤维素累积速率下降的关键因素。推测Expansin、-1,3-葡聚糖酶及蔗糖合成酶基因的协同表达可能在极大程度上决定棉纤维最终比强度。References1黄骏麒. 中国棉作学. 北京: 中国农业科技出版社, 1998: 237-239.Huang J Q. China Cotton Farming. Beijing: China Agri

38、cultural Technology Press, 1998: 237-239. (in Chinese)2刘毓湘. 当代世界棉业. 北京: 中国农业出版社, 1995: 257-266.Liu Y X. Contemporary World Cotton. Beijing: China Agricultural Press, 1995: 257-266. (in Chinese)3Queen M C, Mason N J, Cosgrove D J. Disruption of hydrogen bonding between plant cell wall polymers by pro

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40、 C, Cosgrove D J. Grass group I pollen allergens (-Expansins) lack proteinase and do not cause wall loosening via proteolysis. European Journal Biochemistry, 2001, 268: 4217-4226. 6Kazuo O, Li L K, Kudlicka K, Shigenori K, Jr Brown R M. -Glucan synthesis in the cotton fiber I. Identification of -1,4

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