冻干高活力乳酸菌粉保护剂的研究

1、第!"卷增刊,-!年"-月西北农林科技大学学报#自然科学版$(&9(&(#()(C($.&*/01&/234562)78:573;<8=0>?/8<AB&/1278A(!")(%&*+(,-!D72冻干高活力乳酸菌粉保护剂的研究袁亚宏F岳田利F高振鹏F赵多勇西北农林科技大学食品科学与工程学院F陕西杨陵G#","-$摘H要I以保加利亚乳杆菌为目标菌株F对冻干高活力乳酸菌粉的保护剂进行了研究J结果表明KLG种保护剂对M抗坏血酸N甘油N蔗糖N脱脂奶粉NO谷氨酸N乳-!,型保加利亚乳杆菌

2、保护作用的影响大小次序为K9糖N葡萄糖F其中抗坏血酸P甘油P蔗糖的保护效果最为明显QR真空冷冻干燥法生产高活力保加利亚乳杆菌菌粉的最佳保护剂配方为K抗坏血酸,甘油T蔗糖V脱脂奶粉"谷氨酸"乳糖,-?SF-UOSF-?SF-?SF9-?SF-OOOOOO葡萄糖"-?SJSFO?O关键词I保加利亚乳杆菌Q高活力菌粉Q真空冷冻干燥Q保护剂配方H中图分类号I:H,-"(!)文献标识码I>H文章编号I"HMG"9W!XG#,-!$-9-X,9-!)乳酸菌#是正常人体肠道中极$YZZ_ZaZa为重要的生理菌群之一F具有维持人体微生态平衡P促

3、进消化P防癌抗癌P增强免疫力P抗衰老等作用F与机体健康息息相关J近年来F随着微生态学研究的不断深入和人们保健意识的增强F使乳酸菌作为一种有益菌得到了广泛的研究和开发F目前已广泛应用于保健食品P医药和食品等行业中J由于较难长期保存H"I度进行了探讨F以期最大限度地发挥保护剂的保护功能F减少菌体在冷冻干燥过程中的死亡F提高细胞的存活率F旨在为研制开发高效冻干发酵剂提供依据J"材料与方法"("材菌料种德氏乳杆菌保加利亚亚种因此F乳酸菌的保藏成了热门的研究课题JF利用真空冷冻干燥技术生产活菌制剂是多种保购于中#$F-!,FYZZ_bcbdZe_bcfgff编号M

4、国菌种保藏中心JhHVI活化培养基#培养基$牛奶#市售鲜牛""M,I藏方法中较为理想的一种HJ但真空冷冻干燥过程中F冷冻和干燥两个过程会造成部分微生物细胞的!I损伤P死亡及某些酶蛋白分子的钝化H如果冻干工J奶F理化指标和微生物指标合格F不含抗生素$离心脱脂F灭菌后F置于!灭菌牛-i保温箱中培养!AF奶经检查确实无菌即可使用JHMI计数培养基#jk)培养基$艺中保护剂选择不当F则发酵活力随之下降J不同的保护剂对不同菌种的保护效果是不同的F单一的保护剂并不能满足冷冻干燥的要求F所以抗冻保护剂TI一般都是按一定配方混合使用HJ复配保护剂中的蛋白胨"-?F牛肉膏"

5、;酵母提取物V?葡萄糖,乙酸钠V-?FF-?F柠檬酸二铵,?琼脂粉"吐温9FF-?FX-"UOF?各保护剂在冷冻干燥中均发挥着各自的作用F同时相互间又具有协同作用F况且微生物细胞结构和大小存在差异性F只有复配保护剂中各保护剂的比例及浓度达到协调时F才能达到最佳的保护效果F这就需要通过试验来确定J本研究采用正交试验对抗冻保护剂的组成及浓(VX?FFj?)DTlGm,D-n,moDT,?j<)DTlTm,D加蒸馏水至"-调+-(,V?F-UOF(,pM(TFm至M","i下灭菌"VU8<备用J"(,仪器与设备型高9!

6、VX-oj"k型高速冷冻离心机Qqrstg温高压灭菌机Q9W"T!rustf型电热恒温鼓风干燥箱F!恒温水浴器Q9W,G,9"型电热恒温m)v9rost培养箱Q低温冰箱Q9mmlo:型二氧化碳培养箱Q收稿日期I,EH-!9-W9""基金项目I陕西省科技攻关项目#H,-,!99-"F,-,!99-T$n-uTn-uT作者简介袁亚宏女甘肃天水人讲师博士主要从事食品工程技术研究I#"WG"w$FFFFFJH增刊袁亚宏等n冻干高活力乳酸菌粉保护剂的研究ml#$%型真空冷冻干燥机&+,$-!"()*型生物洁

7、净工作台&*-$,型电./"型超声波清洗机&012子天平&,$+型电子显微镜&+$4(35枪头6+7,工艺流程加入保护剂8菌种活化9扩大培养9离心收集菌体9悬浮液的制备9预冻9真空冷冻干燥9成品+7:操作要点菌种的活化将装有菌种的安培管放入体积分积比C振荡使其混合均匀备用6J,I+C真空冷冻干燥在无菌条件下将菌悬液倒入已灭菌的真空冷冻干燥瓶用报纸包好瓶口以免杂菌污染6将干燥瓶转入低温冰柜中在K,$G左右预冻#H使其均匀冻结在瓶四周内壁上然后开启打开真空泵抽真空度至#=L装好干燥瓶干MNN燥+分别测定其活菌数6将干粉制品保2D+#H后藏在:G冰箱中6+7

8、#测定方法OF活菌数测定E保加利亚乳杆菌以PQ/培养基为计数培养基采用梯度稀释平板计数法即在无菌操作条件下将充分搅匀的检样吸取+=5加入灭菌生理盐水制成+再依次进I+$的均匀稀释液&行+至适当稀释度6吸取+=5置于$倍递增稀释灭菌培养皿中然后倒入约+#=5水浴至#$G左右的PQ摇匀6待其凝固后于/琼脂计数培养基进:$G二氧化碳培养箱中倒置恒温培养:%H后行菌落计数6:F存活率的计算E真空冷冻干燥机等温度降至K:$GDK#$G时数;将封口置于#<的酒精中浸泡,$=>?后取出酒精灯火焰上烧热后立即滴+滴无菌水于封口处将安培管启开然后用无菌水将菌体溶解后吸出放B入盛有液体培养基A

9、培养基C的试管中把塞子+-塞好置培养箱中恒温培养并做空白试验待接种试管中的牛奶凝固后取样镜检确定无杂菌污染后B再将其转接在另外几个盛有液体培养基A培养+-基C的试管中再活化一次6经2方可D,次活化后进行扩大培养6镜检;F用革兰氏染色法E对菌体进行染色染色后置于电子显微镜下观察保加利亚乳杆菌在电子显微镜下呈细长杆状两端钝圆为革兰氏阳性菌6扩大培养B在装有灭菌脱脂牛奶A培养+-细胞存活率JA冻干后+R样品中测得的活菌数S粉剂重量C冻干前+=5TA样品中测得的活菌数S混悬液体积CS+$<+$F活化培养条件E至牛:$G恒温培养约2$H基C的三角瓶中接入已活化的菌种接种量为待其凝固后置于:+$&l

10、t;:$G恒温培养+#D2:HG的冰箱中保存备用6保护剂的制备取%个2#$=5三角瓶分别编;%F号按照5正交试验表E及保护剂与菌泥的比A2C%奶凝固即可6+F计数培养条件E在二氧化碳培养箱中:$G恒温培养空气流量为;<-$(U2体积分数为#二氧化碳流量为:培养时间为T$=5T=5=>?=>?:%D;2H6+7-试验方法如表+所示选择甘油A脱脂奶2$:$=5TCV5例A保护剂I菌泥A体积比C来确定各保护剂J,I+C的用量将所有药品称好后加入三角瓶用蒸馏水溶搅拌均匀6并灭菌备用6解收集菌体制备菌悬液将扩大培养的菌种离心后在无菌操作台中迅速倾去上清液将细胞糊状物A菌泥C加入已灭菌的

11、保护剂中A保护剂I菌泥A体粉A蔗糖A葡萄糖A+$2$RTCV#$+$RTCV#$55乳糖A谷氨酸A+$RTV2$:$RTV*+$2$5C5C5正交试验对试验结果进行分析6;抗坏血酸ATCV+$2$RTC;种保护剂进行5A2CR55%表W正交试验因素水平表LXYZ+!XMNZZM_MNHMRM?XZaN>=?因素!XMN+2甘油TK+Ab5C=5cZdN>?12$:$脱脂奶粉TK+Ab5CR"RNXef=>ZgaMhfN+$2$蔗糖TK+Ab5CR/iNMe(#$+$葡萄糖TK+Ab5CRcZiMe"#$+$乳糖TK+Ab5CR5XMej2$:$谷氨酸T*5

12、K+Ab5CR*5de!+$2$抗坏血酸TK+Ab5CRkc+$2$ed西北农林科技大学学报自然科学版Z第R7卷!结果与分析由表!的极差分析可知"影响菌种存活率的主次因素由大到小依次为#$%$&$($)$*"这说明在以上+种保护剂中"抗坏血酸对菌种的存活率影响最大"其次是甘油,蔗糖,脱脂奶粉,谷氨.-酸和乳糖"在一定范围内"葡萄糖对活菌率的影响最最佳冻干保护剂配方为0抗坏血小/根据极差分析"酸!甘油4蔗糖6脂脂奶粉123"15-3"123"-谷氨酸7乳糖!葡萄糖771123".

13、123"123"11-3/2-表8正交试验及结果分析表9:;<=!>=?<A:B:<C?D?EFEGAHE2EB:<=IJ=GD5=BALKE7!R46P+QT7T!U7U!V优水平WJAD5:<<=O=<因素主次(:XAEGEGY=G%7777!7+7L4R!6RL6+4!LQPPRLRS!1L6R%!77!77!RQLRS7QPLP76SLP14PLP67!LS67&77!77!4+LR!7+LPQP7LQR44L4!7+L47&7*7!7!7!7!1SLQ!76L7Q6!L4P6RLQ17LR4*!)7!

14、7!7!7!7PLS+!1QL1R64L!46!L17!L!R)7(7!77!7!R!L767S!LQ66QL144QL!7SLQR(7#7!7!77!7PSLP4!66LRP4!L47PRLQ4!7L4R#!存活率3MNODO:<G:A=6!LPQPRLRSRRLSR!7L4R+6L114+LR!4QL!7QRL14$($)$*#$%$&R结论糖$脱脂奶粉$-谷氨酸$乳糖$葡萄糖"其中抗.坏血酸对菌种存活率的影响最显著"其次是甘油,蔗糖,脱脂奶粉,谷氨酸和乳糖"在一定范围内"葡萄.-糖对活菌率的影响最小/高活力保加利亚乳杆菌菌粉的最佳生产

15、工艺7Z为0菌种活化扩大培养离心收集菌体悬浮液的制备加入保护剂Z预冻R1"6HZ真空冷冻干燥温度6真空度1时间7P"LP6_"RHZ:粉碎成品/高活力保加利亚乳杆菌菌粉的冻干保护剂影!Z响活菌率因素的主次顺序为0抗坏血酸$甘油$蔗真空冷冻干燥保加利亚乳杆菌的最佳保护剂RZ配方为0抗坏血酸!甘油4蔗糖6123"15-3"1-脱脂奶粉7谷氨酸7乳糖!1123".123"13"-2-葡萄糖73"1123/该复配保护剂能使保加利亚2-乳杆菌在真空冷冻干燥中的存活率达到+6M以上/参考文献a张7a曹永梅"

16、!a李4a林灏"许时婴"等L保护剂在真空冷冻干燥双歧杆菌中的作用食品与发酵工业"aL!117"!Z04146Lb雯"等L嗜热链球菌真空冷冻干燥前后发酵活力变化中国乳品工业"aL!117"PZ07+7SLb华"骆艳娥"刘延琳L真空冷冻干燥微生物的进展微生物通报"aL!11!"RZ0+QQ7Lb云L双歧杆菌冻干保护剂条件的研究科学试验与研究"aL!11!"PZ0RPLb磊L嗜酸乳杆菌生产特性的研究西北农林科技大学学报自然科学版ZaL"!11!"RZ0

17、Q6QQLb贾英民"马Ra田洪涛"6a中国工业微生物菌种保藏中心菌种说明L李元瑞"罗Pa赵瑞香"薛泉宏L微生物学实验技术西安0世界图书出版公司"+a程丽娟"L!111Lca周静芋L试验设计与分析北京0高等教育出版社"Qa袁志发"L!111LcaSa沈萍"范秀容"李广武L微生物学试验北京0高等教育出版社"L7SSSLca李小春L酸奶中乳酸细菌计数法的改进中国乳品工业"71a周哲本"aL7SSP"!Z0R!RRLb微生物学北京0中国轻工业出版社"77

18、a无锡轻工大学编LL7SSQLca下转第QQ页Z西北农林科技大学学报J自然科学版r第q<卷!""#$%&$()(*+!,-$)%()%.)/&.&""#.01$%."/(21%$():=:3456789;7>4?7ABC=EFGH9CI<DDJ<K=_=i<D<jj=kLMMNONLPQNRSTUVRTMTUWXMNRYZLUVRTMXUOVUNNZVUOLZYSNYRVNRSaUVbNZVYcLPdOZVReMYeZNTUWfLZNYZcgTUOMVUOSTTUhVKSVUTDLpp

19、=i<qDjj=rUOWTlVmeTUneVRNoZLWeRYVLUKLlWlVmeTUSTTUhVKSVUTx=4stuv8wu!#y&z&/2&*.%$)|y.*(2&*.$)y.%()%.)/&.&""#.01$%."/(%.$)|./.12$.2=&)2!%/$%&#%()/(#"($)#$"$&)2%(/.%".&1/./.&#$y.2$(&(2$"$)$yy.y&z&/2=p*&%(/(&

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21、G6B9(9CIJ=_KLMMNONLPfLLWRVNURNTUWXUOVUNNZVUOLZYSNYRVNRSaUVbNZVYcLP=i<D<jj=rdOZVReMYeZNTUWfLZNYZcgTUOMVUOSTTUhVKSVUTx_4stuv8wu7y."/.%&)*(/*/.z.2/$.2y$|y&%$%.8&%(#&%$#&%.&."(2./&12$.2#1$)|(*px97x;lTRYL/TRVMMe/eMOTZVRe7y./.1#y(.2y&y.*.%(*.%.)"/.%&)&&*(#($)|:%;"$;8_;#;|p=%|#%./$)1%/(.#<"(2./$y(1*&&%(.#1%(.7y.*.%(*:%|#%./$)&)2k=7_xj|?1|&/./.2$)%y.("$"&#*>.z.2/$.2%(""(1)2"/.%&)*(/"1#&&&*(#($)|:%D