一种生物素改性聚乳酸生物材料的制备与性能研究

1、一种生物素改性聚乳酸生物材料的制备与性能研究*严好,潘君,江伟民,张晓喜,王远亮(重庆大学生物工程学院生物材料与仿生工程中心,生物流变科学与技术教育部重点实验室,重庆400030摘要:研究试图通过本体改性,将生物素接枝到聚乙二醇接枝聚乳酸(P P L A上,以改善聚乳酸微球在药物缓释应用中血液循环时间短和无主动靶向性的缺点。在本实验室制备的聚乙二醇接枝改性聚乳酸的基础之上,采用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法,将生物素接枝到P P L A上,制备生物素改性聚乳酸(B P L A。通过茚三酮显色、核磁共振(1H-NMR,差示扫描量热(D S C,静态水接触角、荧光蛋白标记法对材料进行表征与检测。结果表

2、明,生物素已经共价接枝到聚乳酸上;与P P L A相比,B P L A明显降低了对牛血清白蛋白(B S A的吸附,有望提高聚乳酸微球在血液循环系统中的停留时间;同时能与生物素的配体亲和素结合,有望通过生物素和亲和素的高亲和性实现主动靶向,可能使B P L A在药物缓释中有潜在应用价值。关键词:聚乳酸;生物素;亲和素;生物活性;药物缓释中图分类号:R318.08文献标识码:A 文章编号:1001-9731(201103-0399-051引言自20世纪20年代开始,聚乳酸(P L A作为一种聚酯类纤维广泛应用于医学领域,它具有良好的生物相容性,生物降解性和可吸收性,是经F D A批准应用的可降解合

3、成高分子材料1。近年来,P L A及其共聚物被用作一些半衰期短,稳定性差、易降解及毒副作用大的药物控释制剂的可溶蚀性基材2,该技术的使用有效地拓宽了给药途径,减少了给药次数和给药量,提高了药物的生物利用度,减少了药物对全身特别是肝肾的毒副作用。然而应用中发现P L A在体内易吸附蛋白质等物质,致使P L A微球易被体内的网状内皮系统(R E S清除3。此外,P L A不具有可与靶器官特异性结合的性能,即不具有主动靶向性4。为进一步提高药物的生物利用度,降低P L A对蛋白质等物质的吸附,研究者们将聚乙二醇(P E G链接到P L A上,制备了P L A-P E G嵌段共聚物5。为了赋予P L

4、A比较好的抗非特异性蛋白的吸附性能,研究者们通常选择的P E G分子量都>2000,甚至大于50006。由于P E G分子在体内不易降解7,本实验选用分子量为500的P E G,通过接枝的方式接到P L A 上,制备了P E G接枝P L A。研究结果显示,P E G接枝P L A有很好的抗非特异性蛋白吸附性能8。为赋予P L A主动靶向性,研究者们将可与靶器官特异性结合的抗体或者配体接到P L A上。目前常用的将抗体或者配体接到聚合物上的方式有两种:(1直接共价结合抗体或者配体9,10。这种方式有可能会破坏聚合物的主链结构,使得聚合物更易被降解;也有可能破坏抗体或配体的化学结构,使得抗

5、体或配体的生物活性降低或丧失,从而降低或丧失聚合物的靶向性;(2通过生物识别将抗体或配体结合到聚合物上9。这种方式的反应条件温和,可很大程度地保留抗体或配体的生物活性。目前最常用到的生物识别系统是生物素和亲和素。天然存在的生物素为d型,其分子结构见图1。它依靠分子中的咪唑酮环能与亲和素进行特异性结合,而噻吩环侧链末端的羧基则可共价结合其它基团或分子。亲和素是一种糖蛋白质,分子量为60k D。一个亲和素分子能够和4个生物素分子高特异性结合(K d=10-1511,12,同时抗体或者蛋白质通过与生物素分子上的羧基结合被生物素化后仍保留了与亲和素的高亲和性,而这种生物素化的抗体或蛋白质比较容易合成1

6、3,且已有很多商业化的产品 。图1生物素结构图F i g1T h es t r u c t u r eo fb i o t i n本研究在实验室前期工作基础上,采用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法,将生物素共价接枝到P P L A中,以制备生物素化的P L A,进而可能利用生物素与亲和素的高亲和性,将生物素化的抗体或者配体链接到P L A 上,制备生物活性的聚乳酸。研究采用茚三酮显色、核磁共振、差示扫描量热、水接触角、荧光标记技术证明了生物素化聚乳酸的成功合成,并显示出良好的抗非特异性蛋白吸附和与亲和素结合的性能。993严好等:一种生物素改性聚乳酸生物材料的制备与性能研究*基金项目:国家自然科学基金

7、资助项目(10972243收到初稿日期:2010-07-08收到修改稿日期:2010-08-09通讯作者:潘君作者简介:严好(1985-,男,重庆人,硕士,师承潘君研究员,从事生物材料研究。2实验2.1实验试剂聚乳酸(D,L-P L A,平均分子量:5万,M w/M n= 1.4:实验室自制;马来酸酐(MA,四氢呋喃(T H F,过氧化二苯甲酰(B P O,二甲基亚砜,二甲基甲酰胺(D M F,乙醚,乙醇,水合茚三酮,异丙醇:市售分析纯;氨基封端聚乙二醇(P E G,分子量500,F I T C-B S A:S i g m a公司;生物素,F I T C-亲和素,N,N-二环己基碳二亚胺(D

8、C C,N-羟基琥珀酰亚胺(NH S: P i e r c e公司;双蒸水:M i l l i p o r e。2.2P P L A材料的制备参照文献14制备材料P P L A,现简述如下。取P L A、MA、B P O按一定比例用T H F溶解后混合均匀,迅速放真空干燥箱中室温真空干燥至溶剂彻底挥发;把干燥好的材料放真空干燥箱中,100真空反应10h,然后迅速降至室温,将制备的M P L A取出备用。将制备好的M P L A用T H F溶解,按照其中MA 的量取H2N-P E G-NH2置于圆底烧瓶中,搅拌条件下把M P L A溶液逐滴滴加到圆底烧瓶中,滴加完后油浴5055保温2h。反应产物

9、通过T H F-水体系纯化。将产物在室温下真空干燥,得到产物P P L A。2.3生物素改性聚乳酸材料(B P L A的制备由于P P L A中含有C O O H和NH2两种活性基团,生物素中只含有一个C O O H活性基团,我们采用N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法分两步将生物素与P P L A偶联:首先将生物素,N-羟基琥珀酰亚胺与N, N-二环己基碳二亚胺混合,使之反应生成N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯(B NH S;然后用B NH S与含氨基的P P L A反应制备出生物素改性的P P L A(B P L A,反应原理见图2 。图2B P L A反应原理图F i g2T h er e a c t

10、i o ns c h e m eo fB P L A反应先将生物素,NH S和D C C按物质的量之比为133溶于D M F,室温下磁力搅拌24h;根据文献15所提供的提纯方法,离心除去沉淀(D C U;将上清液用过量乙醚沉淀;取出白色沉淀用异丙醇重结晶4次,真空干燥24h得到白色晶体B NH S。然后按照P P L A中氨基与B NH S物质的量为11的比例溶于D M F中,磁力搅拌下40反应72h,用D M F-水体系提纯,收集水面上的膜,真空干燥48h得到B P L A。2.4B P L A的表征与性能测试称取一定量的P P L A和B P L A,分别加入适量混合溶剂(异丙醇和二甲亚砜

11、体积比11和茚三酮溶0 0 42011年第3期(42卷液(0.1m o l/L的乙醇溶液,水浴85保温15m i n,用紫外/可见光分光光度计(P e r k i n E l m e rL a m b d a900检测在570n m的吸光值。以氘代氯仿(C D C l3为溶剂,四甲基硅烷(TM S为内标,用核磁共振波谱仪(B r u k e rA V5000m o d e l测定P P L A,B P L A的1H-NMR谱图。用差示扫描量热计(W a t e rT AQ200m o d e l测试P P L A、B P L A聚合物的热性能。温度范围080,升温速率5/m i n,气氛为氩气

12、。为检测材料对蛋白的非特异性吸附作用,考虑到血清白蛋白为体内主要的非特异性蛋白,我们以牛血清白蛋白(B S A为模型蛋白,测试了材料对B S A的吸附,操作如下:(1铺膜:取8个直径为35m m的培养皿,其中4个每个加入6m gP P L A,另外4个每个加入6m gB P L A,然后分别加2m L乙酸乙酯溶解。为了同时测试湿度对结果的影响,将含P P L A的2个培养皿和含B P L A的2个培养皿在室温干燥条件下挥发96h 成膜,其余的置于室温(20潮湿条件(相对湿度100%下成膜。(2孵育:分别取浓度为0.02m g/m L 的F I T C-B S A溶液3m L置于8个培养皿中,在

13、37条件下静态孵育30m i n。移走上清液,用双蒸水清洗掉未结合到材料上的F I T C-B S A,直至清洗液中不含F I T C-B S A(通过荧光分光光度计检测。(3检测:用3m LT H F将聚合物及表面的F I T C-B S A溶解,用荧光分光光度计(P e r k i n E l m e rL S-50B以490n m的光激发,测试样品在510n m处的发射光强度。3实验结果3.1茚三酮显色结果及分析由于氨基与茚三酮共热可生成蓝紫色的化合物,该化合物的颜色深浅与氨基的含量成正比,可根据570n m处的吸光值,测定氨基的含量。本实验中,B P-L A的吸光值为0,而P P L

14、A的吸光值为正,定性地说明了P P L A中的氨基全部与B NH S反应。证明生物素已经接枝到P P L A链上。3.2核磁共振测定结果及分析图3是核磁共振氢谱图。a处是聚乳酸主链上的次甲基峰,b和c处是生物素分子上与NH相连的次甲基峰,f处是生物素分子上与S相连的次甲基峰,e,h 是聚乙二醇分子上的亚甲基峰,i是主链上的甲基峰,g 是生物素分子上与S相连的亚甲基峰,d是聚乙二醇上的次甲基峰。通过峰的积分数据我们计算,生物素的接枝率大约为0.99% 。图3核磁共振氢谱图F i g31H-NMRS p e c t r ao fP P L Aa n dB P L A1 0 4严好等:一种生物素改性

15、聚乳酸生物材料的制备与性能研究3.3差示扫描量热结果与分析 图4是差示扫描量热图谱。P P L A 的玻璃化转变温度为25.3,而B P L A 的玻璃化转变温度为30.7,生物素的引入增加了材料的刚性,故B P L A 的玻璃化转变温度较P P L A 高。由于B P L A 和P P L A 都只有一个玻璃化转变温度,因此我们认为提纯方法是有效的,得到的是纯净的产物。 图4差示扫描量热图谱F i g 4D S C S p e c t r a o f P P L A a n d B P L A 3.4水接触角结果分析生物素的结构决定了它的亲水性比氨基差,如果在P P L A 材料中引入了生物

16、素,B P L A 的疏水性将提高,表现为水接触角的增大。图5是水滴在P P L A 表面和B P L A 表面的照片。 图5接触角图像F i g 5C o n t a c t a n g e l s p e c t r u m o f s a m p l e s 水在PP L A 表面迅速铺展开,接触角小到仪器的检测限外,B P L A 表面的水形成小液珠,B P L A 接触角明显大于P P L A 。经测定,B P L A 的平均接触角为66°,肉眼观察P P L A 的接触角不到10°。接触角的显著差别体现了两种材料表面性质的差异,进一步证明了本实验条件下,生物素已

17、经被成功引入到P P L A 中。3.5吸附结果与分析根据所测数据和标准曲线计算得到B S A 和亲和素在材料表面的结合量,见表1。表1B S A 、亲和素在材料表面的结合量T a b l e 1T h e a m o u n t o f F I T C -B S A a n d F I T C -a v i d i n ab s o r b e d o n P P L A a n dB P L A 吸附量(m g /m 2B S A亲和素668根据表1的结果,可以看出,(1B P L A 吸附B S A 的量约是P P L A 的1/2。由于前期研究已经证明P P -L A 具有抗非特异性蛋

18、白吸附能力8,因此,B P L A 具有比P P L A 更强的抗非特异性吸附能力;(2B P L A 吸附亲和素的量是P P L A 的约2倍,证明生物素分子已被引入材料中,且生物素可以与亲和素结合,整个实验过程没有破坏生物素的活性;(3对比B P L A 和P P L A对亲和素和B S A 的吸附,说明了B P L A 对亲和素具有特异性的吸附能力,有望成为制备生物活性聚乳酸材料的前体,通过生物素-亲和素系统引入生物活性物质。4讨论本实验将生物素共价接枝到聚乳酸上,制备了B P L A 材料,与P P L A 相比,它具有更明显的抗非特异性吸附性能,同时能与生物素的配体亲和素结合,显示出

19、特异性的吸附性能。本研究所描述的向P P L A 中共价引入生物素的技术不同于已报道的表面化学改性技术。材料的表面改性有时会随着材料的降解使得改性获得的性质随之消失14。本研究的目的不仅是制备一种新型的含生物素的生物活性材料,更重要的是探索一种能够在降低非特异性蛋白吸附的条件下,向生物材料本体(而不仅是表面共价引入蛋白质、多肽等生物活性分子的制备技术。这为根据需要向P P L A 中引入其它蛋白质、多肽等药物,形成具有全面生理功能的药物缓释材料奠定了基础。文献报道中采用偶联方式将生物素接到聚乳酸末端9,16。先将生物素接枝到P EG 的末端,然后通过P L A 与生物素化的P E G 反应使生

20、物素接在材料主链末端。本实验中采用接枝的方法,将生物素共价接枝到改性P L A 的P E G 侧链上。通过优化反应条件,提高P E G 的接枝率,从而可以提高生物素在P L A 上的接枝率,使一条主链不只接上一个生物素分子。同时也有报道先将亲和素接在聚合物上4,通过生物素-亲2042011年第3期(42卷和素系统,将生物素化的靶向识别分子接到材料上,赋予其主动靶向性。本实验中选用将生物素接到材料上,是考虑到生物素比亲和素分子结构简单,并且活化之后能与氨基比较容易地反应,反应部位能很好地控制,且反应后能维持与亲和素的结合性能。核磁共振和吸附实验的结果说明生物素的接枝率不高,这可能是P P L A

21、 链上的C O O H 与NH 2形成内盐影响了生物素的接枝率,因此有待我们继续改进反应条件;但我们应该注意到,生物体内的某些活性物质在量很少的时候,也能够通过生物的逐级放大过程而引起大的生物响应,因此从这方面考虑,也不需要很大的接枝率。我们分别测试了不同湿度下蛋白的吸附。发现:(1潮湿环境中成膜的吸附量略小于干燥环境下的。这很可能是因为潮湿环境下成膜时亲水的P E G 分子在材料表面的伸展程度更好。(2B P L A 和P P L A 吸附B S A 的量均大于吸附亲和素的量,分析原因可能是由于实验条件的影响。本实验使用的双蒸水室温时pH 值为6.5,F I T C -亲和素的等电点为6,F

22、 I T C -B S A 的等电点为4.8。在蒸馏水中,F I T C-亲和素几乎不带电荷,而F I T C -B S A 则带有部分负电荷。由于P P -L A 中含有的氨基带部分正电荷,通过电荷相互作用,可以吸附更多的B S A ,使得B S A 吸附性能更好。由于一个亲和素分子能够与4个生物素分子进行特异性的结合,生物素又是某些细胞中存在的物质17,18,我们预计,B P L A 通过与亲和素结合,可与某些细胞进行特异性的结合,以期望到达特定的目标。因此,B P L A 有望在靶向药物缓释系统领域得到应用。5结论通过N -羟基琥珀酰亚胺活化酯法,将生物素接枝到P E G 接枝聚乳酸(P

23、 P L A 上,对P P L A 进行本体改性。茚三酮显色、核磁共振,差示扫描量热,静态水接触角以及荧光蛋白吸附实验结果证明,与P P L A 相比,B P L A 能抗非特异性蛋白吸附,且可与生物素的配体亲和素结合。参考文献:1M o o n e y D J ,P a r k S ,K a u f m a n n P M ,e t a l .J .J B i o m e d M a t e r R e s ,1995,29:959-965.2P a r k S J ,C h o i S H ,Y o o n H H.J .J I n d E n g C h e m ,2010,16:101

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29、I A N G W e i -m i n ,Z HA N G X i a o -x i ,WA N G Y u a n -l i a n g(T h e K e y L a b o r a t o r y o f B i o r h e o l o g y S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y u n d e r M i n i s t r y o f E d u c a t i o n ,B i o m a t e r i a l s a n d I n s p i r e d E n g i n e e r i n g C e n t e r ,C

30、 o l l e g e o f B i o l o g i c a l E n g i n e e r i n g ,C h o n g q i n g U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g 400030,C h i n a A b s t r a c t :T h e a i m o f t h i s r e s e a r c h i s t o o v e r c o m e t h e d r a w b a c k s o f P L A i n d r u g d e l i v e r y s y s t e m ,w h i c h

31、a r e s h o r t b l o o d c i r c u l a t i o n t i m e a n d n o n -a c t i v e t a r g e t i n g .B a s e d o n P E G -g r a f t -P L A (P P L A d e v e l o pe d i n o u r l a b ,b i o t i n w a s g r af t e d o n t o P L A t o p r o d u c e B P L A b yNH S -a c t i v a t e d m e t h o d .T h e n

32、i n h y d r i n c o l o r a t i o n ,1H -NMR ,D S C ,w a t e r c o n t a c t a n g l e t e s t ,f l u o r e s c e n c e l a b e l e d p r o t e i n a b s o r p t i o n t e s t w e r e u s e d t o c h a r a c t e r i z e B P L A.R e s u l t s f r o m n i n h y d r i n c o l o r a t i o n ,1H -NMR ,D S C ,w a t e r