HLA配型在致敏受者肾移植中的应用研究

1、HLA配型在致敏受者肾移植中的应用研究【摘要】目的探讨人类白细胞抗原（HLA）配型在致敏受者肾移植中的临床意义。方法应用莱姆德细胞板通过补体依赖微量细胞毒性试验检测受者的群体反应性抗体(PRA);应用单抗湿板进行供受者HLA-类抗原分型；应用微量序列特异性引物(Micro-SSP)进行HLA-类基因分型。结果17例受者PRA阳性率为5.1%80%,平均37.9%;按交叉反应组(CREGs)配型原则，供受者HLA CREGs 0,1和2个错配(MM)者分别为5例(29%)、8例(47%)和4例(24%)，无36个错配者；而按传统的HLA-A,B,DR抗原配型原则，其0,1和2MM分别为1例(6%

2、)，1例(6%)和8例(47%),34MM有7例(41%)；术后仅3例发生急性排斥反应，经OKT3治疗后逆转，所有受者术后肾功能均恢复正常。结论交叉反应组配型可显著提高供受者的HLA相配率；良好的HLA配型对减少致敏受者的肾移植排斥反应、提高移植物存活率具有重要意义。【关键词】人类白细胞抗原;群体反应性抗体;致敏受者;肾移植 A study of HLA matching in sensitized recipients of renal transplantationLI Liuyang,LIN Minzhuan(Medical Department of Hemopurification

3、and Renal Transplantation,Zhujiang Hospital,First Military University,Guangzhou 510282,China)【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical implication of human leukocyte antigen (HLA) matching in sensitized recipients of renal transplantation.MethodsRecipients panel reactive antibody (PRA) was dete

4、cted by using micro-complement-dependent-lymphocytotoxicity test with Lambda cell tray.Donor and recipient HLA class typing was performed with special monoclonal tray and HLA class gene typing with micro-sequence-specific-primers (Micro-SSP).ResultsPRA positive rate in 17 recipients was 5.1% to 80%

5、with an average of 37.9%;patients with 0,1 or 2 mismatch (MM) of HLA crossreactive antigen group (CREGs) were 5(29%),8 (47%) and 4 (24%) cases respectively according to the rule of CREGs matching and no cases had 3-6MM,however the cases of 0,1 or 2 MM were 1 (6%),1 (6%) and 8 (47%) respectively by t

6、he standard of conventional HLA antigen matching and 7 (41%) cases had 3-4MM.Only 3 patients developed acute rejection and were reversed by OKT3 treatment.Renal function returned normal in all patients.ConclusionsThe possibility of good matching was greatly enhanced by the CREGs matching.Good HLA ma

7、tching plays an important role in reducing the incidence of acute rejection and in improving the survival of renal transplants.【Key words】Human leukocyte antigen；Panel reactive antibody；Sensitized recipients；Kidney transplantation我们通过对受者进行群体反应性抗体(PRA)的动态监测，并按美国国立器官分配中心(UNOS)制定的HLA交叉反应组( CREGs )配型原则进

8、行严格的供受者配型1，对致敏受者的肾移植取得了满意效果。报道如下。材料与方法一、 临床资料17例等待肾移植的致敏受者，男7例，女10例，年龄2658岁，平均40.7岁。 其中初次移植16例，二次移植1例。二、 PRA的监测1.试剂： 莱姆德淋巴细胞板(LCT)购自美国One Lambda公司。 该细胞板共含有20种HLA-A抗原特异性，41种HLA-B抗原特异性和10种HLA-C抗原特异性，并且包含若干空白抗原。2.方法：采用补体依赖微量淋巴细胞毒性试验。先分离受者血清，然后按每孔1l将血清加入细胞板，室温孵育30min，每孔加入5l兔补体，继续孵育1h，然后荧光染色固定，在倒置荧光显微镜下读

9、板。最后用电脑软件分析PRA阳性血清中的HLA抗体特异性2。术前每月检测1次受者的PRA水平，移植1周后每周检测23次，动态观察受者的PRA水平和抗体特异性的变化。三、 HLA分型1.试剂：HLA-类单克隆抗体湿板(SMT72R)和HLA-类DNA分型试剂购自美国One Lambda公司；Taq多聚酶购自德国宝灵曼公司；DNA抽提试剂购自德国QIAGEN公司。2.HLA 类抗原分型:采用单抗一步法。用免疫磁珠分离T淋巴细胞，按每孔2000个细胞加入HLA-类单抗分型湿板，室温孵育1h，然后荧光染色固定，在倒置荧光显微镜下读板，电脑分析结果。3.HLA 类DNA分型：采用微量SSP法。用DNA抽

10、提试剂抽提供受者的模板DNA,然后在D-Mix管内加2lTaq酶（5IU/l）,混匀后取出10l混合液加入阴性对照管；再取39l抽提的模板DNA加入上述D-Mix管内，混匀后在31个含不同引物系列的扩增管中分别加入10l D-Mix混合液。密封扩增管，在PCR仪上扩增。结束后，将扩增产物转至微量胶孔（25g/L琼脂糖凝胶）内，140150伏特电泳35min，然后在紫外透射仪上观察并照相，分析软件分析电泳带的格局，确定等位基因。结果一、 移植前受者的HLA致敏状态17例PRA阳性受者中，4例PRA50%，占30%。HLA抗体特异性主要包括A1、A2、A3、A11、A24、A26、A29、A31；

11、B7、B13、B37、B44、B48、B51、B55、B58、B60、B61、B62等，这些抗体所对应的抗原都是中国人群中分布频率较高的HLA抗原。 二、 供受者HLA配型结果对致敏受者尤其是PRA40%的高致敏受者严格按照UNOS制定的CREGs配型原则，并且供者不应有与受者预存的HLA抗体特异性相对应的抗原。如果按照过去HLA抗原配型的原则选择供者，则为致敏受者寻找相配程度高的供者的机率明显降低。从表1可以看出，17例受者中HLA-A、B、DR 0，1，2，3和4MM者分别为1例(6%)，1例(6%)，8例(47%)，5例(29%)和2例(12%)，无56MM者；而按交叉反应组配型原则，其

12、CREGs 0，1和2MM者分别为5例(29%)、8例(47%)和4例(24%)，无36MM者。可见，按照交叉反应组配型原则可显著提高供受者的HLA相配率，其中0表117例致敏受者与供者HLA配型结果例号受者HLA供者HLA位点错配数A,B,DRCREGsA,B,DRCREGsA,B,DRCREGs1A2,11;B40,46;DR81C,2C,7C,21CA2,11;B13,46;DR2,81C,2C,7C,21C202A9,19;B5,17:DR4,62C,5C,10C,21CA2,19;B17;DR32C,10C,21C213A3,19;B7,46;DR2,61C,7C,21CA9,11;

13、B15,46;DR2,61C,2C,21C314A2;B22,46;DR4,62C,7C,21CA2,19;B17,22;DR3,42C,10C,21C325A2,9;B5,46;DR92C,5C,21CA2;B16,46;DR6,92C,8C,21C216A2,19;B17,22;DR3,62C,7C,10C,21CA19;B16,17;DR32C,8C,10C,21C117A9,11;B18,27;DR51C,2C,5C,7CA11,19;B13,40;DR5,71C,7C418A2;B22,46;DR52C,7C,21CA2;B13,15;DR2,52C,7C,21C309A2;B13,

14、46;DR2,52C,7C,21CA2,9;B13,46;DR2,92C,7C,21C2010A2,11;B13,17;DR2,31C,2C,7C,21CA2;B13,15;DR2,52C,7C,21C2111A11;B13,40;DR2,61C,7C,12CA9;B15,40;DR2,52C,7C,21C3212A2,9;B15,16;DR5,92C,8C,21CA2;B40,67;DR5,92C,7C,8C2113A2;B15,46;DR2,92C,21CA9,19;B13,15;DR71C,2C,7C,21C4214A19;B17;DR3,710C,21CA11;B40;DR47C,10

15、C3115A10,11;B15,40;DR2,41C,7C,10C,21CA11;B40;DR47C,10C0016A2,9;B15,40;DR4,62C,7C,21CA2,9;B15,46;DR6,92C,21C2017A2,11;B15;DR2,51C,2C,21CA11;B15,40;DR2,41C,7C,21C22 和1MM者分别提高了23%和41%。 三、 致敏受者的肾移植效果本组17例PRA阳性受者术前均未采取血浆置换等措施清除体内预存的HLA抗体，而是按照严格的HLA配型筛选供者，由于供者没有与受者的致敏抗体相对应的抗原，因此术后无超急性排斥反应发生。术后常规应用泼尼松(Pred

16、)、硫唑嘌呤(Aza)或霉酚酸酯(MMF)和环孢素A(CsA)三联治疗。共有3例在术后1个月内各发生1次急性排斥反应，急性排斥发生率为17%，应用单克隆抗体OKT3治疗后全部逆转，至今未再发生排斥反应；有2例出现急性肾小管坏死，血液透析维持治疗，2周后移植肾开始泌尿，最后肾功能恢复正常而痊愈出院；其余12例均在术后35d肾功能恢复正常，痊愈出院，至今未出现排斥反应。经随访，17例患者中最长的已存活16个月，最短的已存活4个月，肾功能全部正常。四、受者肾移植术后PRA水平的变化17例致敏受者术后动态监测外周血中的PRA水平，结果表明所有受者术后的PRA水平都比较稳定，基本上与移植前保持在同一水平

17、，说明PRA的存在对移植肾的存活并无明显影响，其前提是供受者必须有良好的HLA配型。讨论一、 检测PRA对筛选合适供者具有重要意义致敏受者体内由于存在多价的抗HLA抗体，如果供者具有与受者预致敏的HLA抗体特异性相对应的人类白细胞抗原，进行肾脏移植时必将发生超急性排斥反应，导致移植失败，严重者甚至可能危及受者生命3。Martin等4认为高敏受者存在的抗外源性HLA的同种抗体是肾脏移植的高危因素，不仅难以找到交叉配型阴性的供肾，延长患者的等肾时间，而且移植效果不理想。因此，致敏受者的肾移植难度较大，选择供者应慎重，术前准备要充分。对肾移植受者进行PRA检测，能准确了解其致敏状态，正确判断其致敏抗

18、体的特异性。只有严格按HLA配型原则选择供者，避开受者预致敏的抗体特异性，才能取得满意的移植效果。二、 血浆置换应用于致敏受者肾移植的局限性虽然血浆置换或免疫吸附可以清除或降低受者外周血中预存的致敏抗体，但受者体内合成和分泌抗体的免疫致敏细胞和免疫记忆细胞并未清除，它们始终存在于受者体内，如果再次受到相同抗原刺激，必将发生再次免疫应答，迅速合成和分泌大量的抗体，从而导致超急和加速性排斥反应的发生。这可能就是造成血浆置换后交叉细胞毒阴性的致敏受者仍然发生超急性排斥反应的原因。所以从1998年初开始我们不再给致敏受者进行血浆置换治疗，而是把注意力放在为致敏受者寻找HLA配合程度高的供者上。本组17

19、例PRA阳性受者全部未做血浆置换治疗，但移植效果非常令人满意。三、 CREGs配型原则可提高供受者HLA的相配率Thompson等1研究表明，采用CREGs配型原则与采用传统的抗原配型原则比较，1年和3年移植肾存活率两组间差异无显著性，而供受者HLA的相配率却显著提高。本组17例致敏受者若按抗原配型原则，其0MM和1MM的相配率均为6%，而按CREGs配型原则，则0MM和1MM的相配率分别提高到29%和47%，其临床意义是非常显著的。四、致敏受者肾移植的成功有赖于良好的HLA配型本组17例PRA阳性受者，供受者间按照交叉反应组配型原则，HLA-CREGs错配数仅为02MM。由于供受者HLA相配程度高，因此，只有3例在