蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定

1、第 24卷 第 1期 大 学 化 学 2009年 2月 蛋白质的检测方法与乳制品中蛋白含量测定许家喜(北京 化工大学理学院化工资源有效利用国家重点实验室 北京 100029摘要 介绍 5种常用的蛋 白质检测 方法 , 以及凯氏定 氮法在食 品 , 特 别是乳制品 蛋白含量 测 定中的应用和存在的问 题 , 及其可能的解决方法。最近 , 由于不法商人向乳制品中添加高含氮量的有机化合物三聚氰胺来冒充蛋白质 , 严重 危害了广大消费者的身体健康 , 甚至生命安全。引起了公众对乳制品等食品中蛋白质含量测 定问题的关注。本文在此对蛋白质的检测方法和乳制品中蛋白质含量的测定问题进行简单介 绍。1蛋白质含量

2、的测定方法测定蛋白质总含量是生物化学研究中最常用、 最基本的分析方法之一。目前常用的有 4种经典方法 124:凯氏 (Kj e l d ah l 定氮法、 双缩脲法 (Bi u ret 法 、 Foli n 2酚试剂法 (Lo w ry 法 和紫 外吸收法。另外 , 还有一种在近几十年才 普遍使用起来的较新的测定法 考马斯亮蓝法 (Bradf ord 法 4。1. 1凯氏 (K jeldah l 定氮法将被测试的样品与浓硫酸在硫酸铜和硫酸钾存在下共热消化 , 含氮有机物即分解产生氨、 二氧化碳和水 , 氨与硫酸反应变成硫酸铵。消化后向消化液中加入强碱碱化使之分解放出氨 , 用水蒸气将氨蒸至硼酸

3、液中 , 用标准强酸溶液滴定收集氨的硼酸溶液 , 即可计算出样品的氮含 量 , 从而折算出样品的蛋白质含量 (通常由含氮量乘以系数 6. 25计算出 (该系数为蛋白质平 均含氮量的倒数 , 乳制品通过乘以系数 6. 38计算出 (该系数为乳制品中蛋白质含氮量的倒 数 。这种方法是 K jeldahl 在 1883年发明的 , 当时他只使用硫酸分解试样 , 测定谷物中的蛋 白含量 , 需要较长的反应时间。后来 Gunning 搞清楚了消化机理 , 在消化时加入 K 2S O 4使反应 温度由原来的 380e (硫酸沸点 上升到 400e , 并加入硫酸铜为催化剂 , 提高了消化速度 , 改 进了

4、凯氏定氮法。该方法的缺点是耗时长 , 灵敏度低 , 样品中的含氮化合物会影响蛋白含量的 测定。要想准确测定出蛋白含量 , 可以先测定出总含氮量。再用三氯乙酸将样品溶液中的蛋 白沉淀除去 , 然后测定溶液的非蛋白含氮量 , 最后从总含氮量中扣除非蛋白含氮量就可以比较 准确地测定出样品的真正蛋白含量。1. 2双缩脲法 (B i u ret 法 双缩脲 (N H 3CO NHCON H 3 是两分子的脲经 180e 左右加热 , 放出 一分子氨后得到的产 物。在强碱性溶液中 , 双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物 , 称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基 66或两个直接连接的肽键 , 或间隔一个碳原子相连的肽

5、键结构的化合物都可以发生双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比 , 而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关 , 可用来测 定蛋白质含量。测定范围为 110mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有 :硫酸铵、 Tris 缓冲 液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 , 不同的蛋白质产生颜色的深浅相近 , 以及干扰物质 少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速、 但并不需要十分精确的蛋白质 测定。1. 3Folin 2酚试剂法 (Low ry 法 Foli n 2酚 试剂法 (Lo w r y 法 是由 Lo wry 在双缩脲方法的基础上发展的。他在双缩脲试剂的 基础上又增加了一种

6、增强显色的试剂 磷钼酸和磷钨酸的混合液 , 它们被蛋白质中酪氨酸 残基的酚羟基还原 , 产生深蓝色 (钼蓝和钨蓝的混合物 , 以增加显色量 , 从而提高了检测蛋白 质的灵敏度。该测定法的优点是灵敏度高 , 比双缩脲法灵敏得多 , 此法可检测的最低蛋白质量 达 5L g 。通常测定范围是 20250L g 。缺点是费时较长 , 要精确控制操作时间。因 Lo wry 反应 的显色随时间不断加深 , 因此各项操作必须精确控制时间 , 标准曲线也不是严格的直线形式 , 且专一性较差 , 干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子 , 同样容易干扰 Lo wry 反应 , 而 且对后者的影响更大。酚类、

7、柠檬酸、 硫酸铵、 T ris 缓冲液、 甘氨酸、 糖类、 甘油等均有干扰作 用。由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸 , 显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本 测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度 (相对于标准蛋白质 。1. 4考马斯亮蓝法 (Brad ford 法 双缩脲法和 Foli n 2酚试剂法的明显缺点和使用限制 , 促使科学家去寻找更好的蛋白质含 量测定方法。 1976年 , 由 Bradf ord 建立的考马斯亮蓝法 (Bradf or d 法 是根据考马斯亮蓝 G 2250染料在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸 (特别是精氨酸 及芳香族氨基酸残基相结合 , 使 染料最大吸

8、收峰的位置 (K m ax 由 465n m 变为 595nm, 溶液的颜色也由棕黑色变为蓝色的原理 设计的 4。在 595nm 下测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比。这一方法是目前灵敏度最高 的蛋白质测定法 , 因而正在得到广泛的应用。考马斯亮蓝法的突出优点是 :(1 灵敏度高 , 比 Lo wry 法约高 4倍 , 最低蛋白质检测量可 达 1L g 。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大 , 蛋白质 2染料复合物有更高的消 光系数。 (2 测定快速、 简便 , 只需加一种试剂。完成一个样品的测定一般只需要 5分钟左 右。由于染料与蛋白质结合的过程大约只要 2分钟即可完成 , 其颜色可

9、以在 1小时内保持稳 定 , 且在 5分钟至 20分钟之间 , 颜色的稳定性最好。因而完全不用像 Lo wry 法那样费时和严 格地控制时间。 (3 干扰物质少。如干扰 Lo wry 法的 K +、 Na +、 Mg 2+、 T ris 缓冲液、 糖和蔗糖、 甘油、 巯基乙醇、 EDT A 等均不干扰此测定法。此法的缺点是 :(1 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同 , 因此用于不 同蛋白质测定时有较大的偏差。 (2 主要的干扰物质有 :去污剂、 Triton X 2100、 十二烷基硫酸 钠 (S DS 和 0. 1mol/L的 N a O H 。 (3 标准曲线有轻微的非线性

10、 , 因而不能用 Beer 定律进行计 算 , 而只能用标准曲线来测定。1. 5紫外吸收法蛋白质分子中的酪氨酸、 苯丙氨酸和色氨酸残基使其在 280nm 处具有紫外吸收 , 其吸光 度与蛋白质含量成正比。此外 , 蛋白质溶液在 238nm 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一 67定波长下蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系可以测定蛋白质含量。紫外吸收法简便、 灵敏、 快速 , 不消耗样品 , 测定后能回收。低浓度的盐和大多数缓冲液不 干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差 , 专一性差 , 干扰物质多 , 若样品中含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能

11、吸收紫外光的物质 , 会出现较大的干扰。虽可以校正 , 但还是存在一定的误 差。在用标准曲线法测定蛋白质含量时 , 对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大 的蛋白质 , 有一定的误差。故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。此外 , 由于蛋白质吸收峰常因 p H 的改变而有变化 , 因此测定样品时的 p H 要与测定标准曲线的 p H 一致。表 15种常用蛋白质含 量测定方法比较方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明凯氏定氮法 (K j edah l 法 灵敏 度 低 , 适用 于 0. 21. 0m g 氮 , 误差为 ? 2%费时810小时将蛋 白氮 转化 为氨 , 用

12、酸吸 收后 滴定 测定 , 再转换成蛋白含量非蛋白氮 (可用 三氯乙酸沉淀蛋白质而分离 用于标准蛋白质含 量的 准确 测 定 ; 干 扰少 ; 费时长双缩脲法 (Bi u ret 法 灵敏度低120m g中速2030分钟肽键 与碱 性 Cu 2+生 成紫色 络合 物 , 通 过紫 外测定硫 酸 铵 ; K +、 Na +、Mg 2+; Tris 缓 冲 液 ;某些氨基酸用于 快速 测 定 , 但 不太 灵敏 ; 不 同 蛋 白质显色相似Folin 2酚 试 剂 法 (Lo wry 法 灵敏度高约 5L g慢速4060分钟双缩脲反 应 ; 磷钼酸 2磷钨酸试 剂被 Tyr 和 Phe还原硫酸铵

13、; T ri s 缓 冲液 ;甘氨酸 ; 各种硫醇费时 较长 ; 操 作 要 严格 计时 ; 颜 色 深 浅与蛋白有关紫外吸收法 较为灵敏 50100L g 快速510分钟蛋白中的酪氨酸和色氨酸 残 基 在 280nm 的 光吸收各种嘌 呤和 嘧啶 ; 各种核苷酸用于 层 析柱 检 测 ; 核酸吸收可以校正考马斯亮蓝法 (Brad f ord 法 灵敏度最高15L g快速515分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质 结 合 时 , 其 Km ax由465nm 变为 595nm强碱性缓 冲 液 ; S DS ;TritonX 2100干扰 物质 少 ; 颜 色 稳定 ; 颜 色深 浅 与 蛋白质有关可见 ,

14、 考马斯亮蓝法和 Foli n 2酚 试剂法灵敏度最高 , 比紫外吸收法灵敏 1020倍 , 比双缩 脲法灵敏 100倍以上。考马斯亮蓝法由于其突出的优点 , 正得到越来越广泛的应用。但表 1中的后 4种方法并不是通用的 , 不能在任何条件下适用于测定任何形式的蛋白质 , 因为即使同 一种蛋白质溶液用这 4种方法测定 , 也有可能得出 4种不同的结果。即每种测定法都不是完 美无缺的 , 都有其优缺点。在选择蛋白质含量的测定方法时应考虑 :(1 测定所要求的灵敏度 和精确度 ; (2 蛋白质的性质 ; (3 溶液中存在的干扰物质 ; (4 测定的花费 , 包括材料费、 仪 器和工时。凯氏定氮法虽

15、然测定过程稍微复杂些 , 但通用性强 , 测定费用低、 仪器简单 , 且较准 确 , 因此 , 常用来测定食品中蛋白质的含量。2乳制品中蛋白含量测定蛋白质的测定方法分为两大类 :一类是利用蛋白质的共性 , 即含氮量 , 肽链和紫外吸收测 定蛋白质含量 , 另一类是利用蛋白质中的特定氨基酸残基以及酸、 碱性基团和芳香基团测定蛋 白质含量。由于食品种类很多 , 食品中蛋白质含量又各不相同 , 特别是其他成分 , 如碳水化合 68物 , 脂肪和维生素的干扰成分很多。而凯氏定氮法因其通用性强 , 测定费用低 , 仪器简单 , 且比 较准确。因此常用凯氏定氮法来测定食品中的氮含量 , 由氮含量计算出蛋白

16、质的含量。 目前我国食品中蛋白质含量测定的国家标准就是通过凯氏定氮法来测定的 5。在检验 食品中蛋白质时 , 往往只限于测定总氮量 , 然后乘以氮换算为蛋白质的系数 (乳制品为 6. 38, 面粉为 5. 70, 玉米、 高粱为 6. 24, 花生为 5. 46, 米为 5. 95, 大豆及其制品为 5. 71, 肉与肉制品为 6. 25, 大麦、 小米、 燕麦、 裸麦为 5. 83, 芝麻、 向日葵为 5. 30, 得到蛋白质含量 , 实际上这样测定 的蛋白质含量包括核酸、 生物碱、 含氮类脂、 卟啉和含氮色素等非蛋白质含氮化合物 , 故称为粗 蛋白质。凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量 ,

17、 而是通过测氮含量来推算蛋白质的含量。不法 商人就是利用了这一点 , 通过向乳制品中加入高含氮量的有机化合物三聚氰胺来提高其产品 的 /蛋白 0含量的。在正常情况下 , 对于食品 , 特别是乳制品中蛋白质含量测定 , 这个测定方法 是没有问题的 , 因为食品 , 特别是乳制品中的主要成分中只有蛋白质含有氮 , 其他主要成分脂 肪、 碳水化合物都不含氮。因此 , 应该说目前食品中蛋白质含量测定的国家标准采用凯氏定氮 法 , 通过测定食品中总含氮量来计算蛋白质含量的方法在理论上并没有错。但是 , 如果有人往 样品中加入高含氮的其他物质 , 如三聚氰胺 , 就可以骗过凯氏定氮法获得虚假的蛋白质高含

18、量。这样 , 就可以通过向原奶中兑水 , 把水当作牛奶来卖 ; 向奶粉中添加淀粉等 , 将淀粉等当作 奶粉 , 甚至婴幼儿配方奶粉来出售。面对这一问题 , 仅通过建立食品、 特别是乳制品中三聚氰 胺的检测方法是不够的 , 因为不法分子为了商业利益可能还会 /研发 0其他高含氮化合物作为 新的 /蛋白精 0来替代受到高度关注的三聚氰胺。我们应该面对现实 , 修改目前的食品中蛋白 质含量测定的国家标准 , 参考或采用早就成为检测牛奶氮含量的国际标准 (I S O 8968, 在凯氏 定氮法测定样品的总含氮量之后 , 再取一份样品 , 先用三氯乙酸处理样品 , 让蛋白质形成沉淀 , 过滤后 , 分别测定沉淀和滤液中的氮含量 , 就可以知道蛋白质的真正含量和冒充蛋白质的物质 的氮含量 , 这是生物化学实验教科书中的方法。只有改进国家标准 , 堵住漏洞 , 才能真正保证 人们吃上放心的食品。参 考 文