MTT法进行活菌计数的方法学探讨

1、MTT 法进行活菌计数的方法学探讨王 栩 , 邬于川 , 夏世平 , 高 燕 , 李程旭(泸州医学院微生物学与免疫学教研室 , 四川泸州 646000 摘 要 目的 :建立一种快速 、 稳定 、 灵敏并可反映细菌活性的细菌计数方法 。方法 :以大肠杆菌为研究对象 , 探讨 MTT 法用于细菌计数的可行性及反应时间 、 测量细菌数量的范围 、 MTT 的用量 、 是否加入溶解剂等实验条件 。结果 :细菌数在 3. 8×1071. 2×109ml 范围内测出的 OD 值与细菌浓度呈良好的正相关 , 反应时间为 20分钟 ,MTT10l 、 20l 均可 ,20l 效果更佳 。

2、可不用溶解剂 。 结论 :MTT比色分析法可用于检测活菌数量 。关键词 MTT 比色法 ; 活菌计数 ; 方法学中图分类号 R372 文献标识码 A 文章编号 1000-2669(2002 04-0291-03 在微生物学 、 免疫学以及其他学科的实验中 , 常 用一定浓度的活菌作为实验材料 , 这就涉及到一个 活菌计数的问题 。 法有比浊法 、 分光光度计测定法 、 涂布法等 。 前两种操作方法简单 , 数量 , 不能判断细菌的活性 ; 菌数 , 但方法繁琐 , 重复性较差 , 比色分析法由 M osmann 1(的四甲基偶氮唑盐 , 而且形成的 量与活细胞数量成正比关系 。此方法具有简单

3、、 快 速 、 灵敏 、 稳定之特点 , 克服了常规方法的不足之处 。 MTT 法目前大多用于免疫细胞及其他细胞的活性检测2, 未见用于细菌等微生物的活性检测的报道 。本实验以大肠杆菌为研究对象 , 对 MTT 法用于测量活菌数的可行性及实验条件进行了探讨 。 1 材料和方法 1. 1 细菌将大肠杆菌的标准菌株 (埃希氏菌 44664, 购于 中国药品生物制品鉴定所 培养于肉汤管 , 放 37 恒温箱孵育 1824小时 , 用比浊法定量后 , 倍比稀 释成 8种浓度 。1. 2 试剂MTT (sigma 溶于 pH7. 4P BS , 浓度 5mg ml , 过滤 除菌 ,4 冰箱避光保存 。

4、 二甲基亚砜 (DMS O 。 1. 3 MTT 比色法测定取不同浓度的大肠杆菌肉汤培养物 , 加入 96孔平底培养板 (美国 Nunc , 每孔 100l , 各做 5个复孔 ,作者简介 :王 栩 (1974- , 女 , 助教 。按 10l 孔或 20l 孔加入 MTT 溶液 , 放 37 恒温箱10分钟 ,20分钟 ,40分钟后取出 , 加或不加 DMS O , 570nm 下 , 其生成 量随活菌数的增多而增加 , 细菌数在 3. 8×1071. 2×109ml 范围内与 OD 值成正相关 , 线性良好 , 其相关系数 r =0. 9998, P <0. 01

5、。图 1 OD 值与细菌数的关系2. 2 MTT 的量对结果的影响 (图 2 分别在细菌数相同的孔中加入 MTT (5mg ml 10l 或 20l , 反应后测 OD 值 , 结果如图 2所示 , 各孔 OD 值随 MTT 的量增加而有所增加 , 在测量范围内 ,细菌数与 OD 值均呈正相关 , 但加入的 MTT 量为 20l 时 , 相关性更好 。 MTT 量为 10l , r =0. 9749, P <0. 01;MTT 量为 20l , r =0. 9998, P <0. 01。 2. 3 反应时间对结果的影响 (图 3在孔中加入 MTT 后 , 用肉眼可观察到浓度高的两孔

6、 (1. 2×109ml 和 6×108ml 几乎立即出现均匀192泸州医学院学报 2002年 第 25卷 第 4期Journal of Luzhou Medical C ollege V ol. 25 N o. 4 2002本页已使用福昕阅读器进行编辑。福昕软件(C2005-2008,版权所有, 仅供试用。的蓝紫色 , 放 37 孵箱 10分钟后取出 , 发现除前两孔外 , 后几孔无明显变化 , 继续放孵箱 20分钟 、 40分钟后取出测 OD 值 , 结果如图 3所示 , 反应 20分 钟 , 各孔的 OD 值已有明显的梯度变化 ,OD 值与细 菌数之间的相关系数 r

7、=0. 9998, P <0. 01; 反应 40分钟后 , 测出的 OD 值稍有增加 ,OD 值与细菌数之 间的相关系数反而降低 (r =0. 9735 。实际测定中 , 反应 20分钟即可 。图 2 MTT 的量对 OD 值的影响 图 3 反应时间对 OD 值的影响2. 4 溶解剂对结果的影响 (图 4 反应时间终止时 , 肉眼观察各孔中呈现深浅不同但很均匀的蓝紫色 , 倒置显微镜 (40× 下观察 , 有 大团分布均匀的蓝紫色颗粒 , 加入 DMS O 后 , 观察到 颗粒变小 、 变少 , 但 OD 值的测量结果如图 4所示 , 加入 DMS O 前后 OD 值无显著差

8、异 。图 4 溶解剂对 OD 值的影响3 讨 论活细胞体内的线粒体脱氢酶将淡黄色的 MTT代谢后形成蓝紫色的甲月替 , 该物质在 560610nm 中 有一个较宽的最大吸收峰 , 用酶标仪可对其进行直接测量 , 其值与活细胞的数量有良好的线性关系 3。 本实验对使用酶标仪测定活菌数量的 MTT 法进行了探索 , 实验结果表明 : 细菌浓度在 3. 8×1071. 2×109ml 时 ,OD 值与活菌数呈良好的正相关 。此 测定范围完全可满足一般检测的需要 。 MTT 的量用 10l 或 20l 均可 , 但 MTT 为 20l 时 ,OD 值与活 菌数间的相关性更好 。 反

9、应时间为 20分钟时 ,OD 值与细菌浓度呈良好的正相关 , 延长反应时间 , OD 。 加入 MTT 后 , , 孔中呈现均匀的, O 前后 , 结果没 , 。这点 MTT 比色法有所不 , 可能与原核细胞和真核细胞代谢特点的差异 以及反应时间不同有关 , 有待进一步探讨 。综上所 述 , 我们认为 MTT 比色分析法可用于测量活菌数量 , 较好的实验条件为每孔加 MTT (5mg ml 20l ,37 孵育 20分钟 , 可不加溶解剂 , 在 570nm 波长测 定 OD 值 。此法经济 、 简便 、 快速 、 稳定 、 灵敏度高 , 且测出的为活菌数量 , 具有传统细菌计数法所无法 比拟

10、的优点 , 可满足一般临床及基础检测的需要 。参 考 文 献1. M osmaan T. C olorimetric assay cellular growth and survival :Application to proliferation and cytotoxityassays J.J Immu 2nolMethods , 1983; 65(1 :552. 李影林 . 中华医学检验全书 (下卷 M.北京 :人民卫生出版社 , 1997; 22123. 薛 彬 . Edeman A , Thorbecke G J. 介绍一种用颜色显 示法测细胞的生长及增殖 J.北京医科大学学报 ,19

11、87; 19(2 :1254. 林忠宁 , 董胜璋等 . MTT 法检测 T 淋巴细胞增值功能的方法学探讨与应用 J.中国卫生检杂志 , 2002; 10(1 :8(2002-02-28收稿 292泸州医学院学报 2002年 第 25卷 第 4期Journal of Luzhou Medical C ollege V ol. 25 N o. 4 2002INQUIRING INTO THE METH OD OF COUNTING LIVE GERM WITH MTTWang Xu , et alDepartment o f Microbiology and ImmunologyAbstract

12、 Objective :To establish a rapid ,steady and sensitive germ counting method that could reflect the germ s activity. Methods :E. coil was em ployed to determine the conditions of assay ,which include the feasibility ,reaction peri 2 ods ,germ s number concentration of MTT and s o on. Re sults :The OD

13、 has a direct relativity with the concentration of germ when the number of the germ is in the period of 3. 8×1071. 2×109ml by reacting with 10or 20l MTT , (20l is better ,without diss olvent matter. Conclusion :MTTcolorimetry could be used to measure the am ount of live germ. K ey w ords M

14、TT colorimetry ; Live germ counting ;Methods重型病毒性肝炎 90例死因分析李叶辉 ,(, 重型病毒性肝炎 (简称重肝 , 其病死率在各型肝炎中居首位治各型肝炎 3799例 0. %, 死亡 90例 (占 90% ,1 临床资料1. 1 一般资料本组 90例死亡患者中 :急性重肝炎 (急重肝 4例 ; 亚急 性重肝肝炎 (亚重肝 60例 ; 慢性重型肝炎 (慢重肝 26例 。 男性 68例 (占 75. 5% , 女性 22例 (占 24. 4% 。男女比例 3. 08:1, 年龄最小 5岁 , 最大 70岁 。诊断 标 准 :1990年 至 1994

15、年 , 按 1990年上海全国病毒性肝炎诊断治疗方案 ;1995年至 1998年按 1995年北京病毒性肝炎防治方案确诊 。 1. 2 免疫学检查90例患者凝血酶原时间 (PT 明显延长 。 H AVIgM 阳性 2例 ;HE VIgM 阳性 2例 ; HC VIgM 阳性 10例 ; 其余 H BsAg 均阳 性 。 其中 4例甲 、 戊肝均重叠感染了乙型肝炎病毒 。肝功 能 :T B1170um ol L 900um ol L (正 常 值 021um ol L , A LT 100U L50例 , 300U L20例 , 其它均异常 (A LT 正常值 0 40U L 。1. 3 并发症

16、1种并发症者 30例 ;2种并发症者 34例 ;3种并发症者 26例 。 多数患者病程中不同程序合并肝性脑病 , 消化道出 血 , 肝肾综合征 , 脑水肿 , 急性胰腺炎 , 自发性腹膜炎 , 胆道感 染等 。1. 4 死亡原因直接死于肝性脑病 36例 (占 40% , 死于消化道大出血 9例 (占 10% , 死于肾功衰竭 10例 (占 20% , 死于多种并发 症者包括感染 , 自发性腹膜炎 , 胆道感染 、 脑疝等 27例 (占 30% 。 论重肝最主要死亡原因为肝性脑病 , 肝肾综合征 , 消化道 出血 , 其次为感染 , 脑疝等 。 并发肝性脑病 35级及肝肾综 合征者病死率为 10

17、0%。病原学分析 ,90例死亡重肝中 , 甲 、 戊型肝炎各 2例 (占 2. 22% , 但均重叠感染乙肝病毒 ; 丙肝 10例 (占 11. 1% , 其 中 5例重叠感染乙肝病毒 ; 无重叠感染的乙型炎死亡 78列 。 表明重肝多见于乙型肝炎病毒感染 。肝性脑病是重肝死亡的主要原因 。昏迷程度均为 35级 , 提示昏迷程度越深病死率越高 。 及早给予抗昏迷预防感 染 , 纠正电解质紊乱 。 积极防治诱因是重肝治疗的重点 。 重肝病人常发生消化道出血 , 除因门脉高压为主外 , 亦 有因广泛胃粘膜糜烂或者因肝性溃疡出血者 。 对策 :内科保 守治疗效果有限 , 对大量出血 , 反复出血 , 一般情况尚可者 , 宜尽早外科手术止血 , 否则可配合胃粘膜保护剂及 2受体 阻滞剂等治疗 。肝紧综合征是重肝独特的综合征 , 是重肝病人危及生命 的并发症之一 。 但治疗无理想的方法 。扩血管药物无明显 效果 , 透折疗法仅适用于某些选择性病员 , 早期可用甘露醇 , 速尿