二甲双胍对兔动脉粥样硬化NF-κB表达及血清高敏C反应蛋白水

1、二甲双胍对兔动脉粥样硬化NF-B表达及血清高敏C反应蛋白水平的影响动脉硬化(arteriosclerosis,AS)目前被认为是血管壁的慢性炎症增殖性疾病1,多种炎症因子参与了AS的发生发展。核因子B(nuclear factor-kappaB,NF-B)是一种具有多向基因转录调节作用的蛋白质,活化的NF-B可以调节多种基因尤其是炎症免疫相关基因的转录,如趋化因子、细胞黏附分子、细胞因子等。研究表明,NF-B广泛存在于AS病变处血管平滑肌细胞、内皮细胞及单核巨噬细胞中2, 3,其活化目前被认为是AS发生的始动机制之一。已证实降糖药物二甲双胍(metformin)对实验动物有显著的抗动脉粥样硬化

2、特性4,著名的英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)也发现二甲双胍具有独立于其降糖作用以外的降低2型糖尿病患者大血管病变(主要是AS)发生率和死亡率的作用5, 6。本实验通过观察二甲双胍对动脉粥样硬化家兔主动脉血管壁细胞中NF-B及其抑制蛋白IB表达的影响和血清中高敏C反应蛋白(hs-CRP)浓度的变化,来探讨其可能的抗AS机制。材料和方法1材料胆固醇和牛血清白蛋白(BSA,武汉亚法生物技术有限公司), hs-CRP试剂盒(上海申索佑福医学诊断用品有限公司), NF-B p65单克隆抗体和IB多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司),羊抗兔HRP-IgG(Santa Cruz),十二烷基硫酸钠-聚

3、丙烯酰胺(SDS-PAGE)和硝酸纤维素膜(NC膜)(Invitrogen),ECL发光剂(Pierce),盐酸二甲双胍片(北京京丰制药有限公司)。2方法2.1家兔AS模型的建立健康25月龄雄性新西兰大耳白兔24只(普通级,购自同济医学院实验动物中心),适应性喂养1周后,采用随机数字表法分为3组:空白对照组(control组,8只)、粥样硬化组(AS组,8只)和二甲双胍治疗组(Met组, 8只)。Control组每只家兔给予普通饲料150 g/d,自由饮水;AS组和Met组家兔经耳缘静脉1次性注射10%牛血清白蛋白1 mL/kg,随后给予高脂饮食(含胆固醇1%、猪油75% )150 g/d,自

4、由饮水。饲养至第8周,经升主动脉高频超声探查(GE Vivid 7彩色多普勒超声仪, i13L术中探头),可见与control组比较,AS组和Met组家兔升主动脉内中膜( intima-media thickness, IMT)明显增厚,并可见斑块形成(图1),提示AS模型建立成功。AS组继续高脂饮食喂养,Met组在高脂饮食喂养的基础上给予二甲双胍150 mgkg-1d-1(二甲双胍片溶于生理盐水中配制成5%溶液,每日定时灌胃1次;家兔体重每周记录1次,据此调整灌胃剂量)。家兔均分笼喂养,喂满16周。Fig 1Sonogram of ascending aorta on the 8thweek

5、. Left: chol-esterolenriched diets feeding group (AS group or Mettreatmentgroup); right: control group. AAO: ascendingaorta; IMT: arterial intima-media thickness; pla: ath-erosclerotic plaque.图1第8周时,高脂喂养的家兔(AS组和M et组)与con-trol组家兔的升主动脉超声图像2.2血脂血糖及血清hs-CRP的测定分别于实验第0、8、16周经耳中动脉取空腹血2 mL, 3 000 r/min离心10

6、 min,采用酶标法测定血清总胆固醇( totalcholestero,l TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholestero,lHDL-C),采用Friedwald公式计算低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholestero,l LDL-C);按照CRP试剂盒说明检测血清hs-CRP浓度。2.3病理学观察3组动物在喂满l6周后经兔耳缘静脉注入过量苯巴比妥钠处死,开胸、迅速分离、离断升主动脉至腹主动脉段血管。取主动脉弓处约05 cm血管组织置入10%中性甲醛缓冲液中

7、固定24 h,经脱水、透明、浸蜡、包埋与石蜡切片处理后,行HE染色,光镜下经摄相装置输入彩色病理图像分析系统。其余血管组织置入冻存管中-70冰箱中保存。2.4免疫组织化学染色石蜡包块每4m切片,采用免疫组织化学SP法检测主动脉壁NF-B p65和IB的表达情况,严格按说明书操作。2.5Western blotting取出冻存于-70的血管组织,采用RIPA裂解缓冲液分别提取胞浆蛋白IB和胞核蛋白NF-B p65亚基, Bradford法测定蛋白质含量;加2SDS上样缓冲液煮沸5min后上样,每孔20g,以8% SDS-PAGE凝胶电泳分离(200 V、45 min),以湿法转硝酸纤维素膜(10

8、0 V、60 min);丽春红S应用液染膜, PBS液洗膜3 min3次; 3%BSA封闭1 h后, PBS液洗膜15 min3次,加入抗4孵育过夜,再洗膜15 min3次后加入辣根过氧化物酶标记的抗,室温下孵育1 h,洗膜15 min3次后,标准ECL法底物发光。用凝胶成像分析软件Gelpro32对蛋白含量密度分析,并与内参照结果比较。每组实验重复3次。3统计学处理数据用均数标准差(-xs)表示,选用SPSS130统计软件,组间差异性比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)。结果1一般情况实验过程中,AS组有一只家兔死亡,Met组有2只家兔死亡,至实验结束正常对照组有8只家兔,AS

9、组7只家兔,Met组6只。实验结束时3组家兔的体重无显著差异(P005)。2血脂结果0周时,各实验组家兔的血脂水平无显著差异; 8周、16周时,AS组与Met组家兔血脂水平与control组比较明显升高(P005),见表1。表1各组家兔血脂水平的改变Tab 1Changes in blood lipids level of rabbits in each group(mmol/L.-xs.n=6)Group 0 week 8thweek 16thweekControlTC 1. 660. 06 1. 580. 16 3. 530. 60TG 0. 720. 09 0. 750. 22 0. 8

10、20. 17HDL-C 0. 570. 13 0. 580. 09 0. 660. 07LDL-C 0. 600. 15 0. 630. 12 2. 520. 61ASTC 1. 550. 11 24. 012. 79*47. 177. 22*TG 0. 770. 16 3. 210. 56 2. 641. 05HDL-C 0. 610. 10 1. 130. 34 0. 700. 18LDL-C 0. 540. 21 21. 422. 54*45. 286. 92*MetTC 1. 670. 09 23. 842. 19*41. 3811. 73*TG 0. 760. 13 3. 260.

11、61 2. 271. 61HDL-C 0. 580. 12 1. 080. 19 0. 650. 13LDL-C 0. 570. 17 21. 011. 76*39. 7011. 14*P005vsAS group.3血清中hs-CRP的浓度如表2所示,AS组家兔血清hs-CRP较之control组显著增高(P001);给予二甲双胍干预8周后Met组家兔血清hs-CRP有较明显的降低(P005)。4主动脉病理学改变Control组主动脉内膜大致正常,内皮细胞完整表2血中hs-CRP浓度变化Tab 2Serum hs-CRP level in each group (mg/L.-xs.n=6)G

12、roup Serum hs-CRPControl 1. 270. 43AS 3. 960. 63*Met 2. 790. 40*P001vscontrol group;*P005vsAS group.连续;AS组主动脉内膜明显增厚,内皮细胞损伤脱落,平滑肌细胞显著增生,可见到由大量泡沫细胞构成的脂质斑块,斑块内尚有较多炎症细胞浸润;Met组内膜增生程度较AS组明显减轻,斑块体积显著减小,见图2。5NF-B p65和IB的免疫组织化学分析NF-B p65的表达以血管壁细胞(内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞)胞核黄褐着色为阳性; IB的表达以血管壁细胞胞浆和胞膜黄染为阳性。Con-trol组血管壁很

13、少见到胞核NF-B p65阳性表达细胞,细胞胞浆中IB呈较强表达; AS组血管壁NF-B p65呈强表达,多数细胞胞核中可见到大量黄褐色颗粒状物沉积, IB的表达较之control组明显减少;Met组血管壁中亦可见一定数量NF-Bp65阳性表达细胞,但较AS组表达明显减弱, IB的表达较AS组有所增强,但弱于control组,见图3。6W estern blotting分析电泳条带及半定量分析显示, control组胞核内仅有少量NF-B p65亚基表达,AS组NF-B p65表达量增加(P001), Met组与AS组比较可见NF-B p65亚基的表达减少(P005);AS组胞浆IB降解,较c

14、ontrol组表达减少(P001),Met组与AS组比较胞浆IB表达增加(P005),见图4、5。讨论AS是多因素疾病,近年来病理生理学研究证实,AS是慢性低度炎症性疾病1, 7。核因子B作为一种核转录调节因子,主要由p50和p65两个亚基组成,静止状态下与其抑制蛋白IB结合以三聚体的形式存在于细胞浆中,受到某些刺激(如氧化应激、LPS、TNF-等), IB在IB激酶(IKK)的作用下磷酸化而最终泛素化降解,活化的NF-B p65转入胞核,与靶基因上启动子区域的特定序列特异性结合,启动相应基因转录和蛋白质表达。NF-B调节多种炎症及免疫相关基因的表达,其众多靶基因表达产物(如IL-6、IL-8

15、、IFN、CRP、MMPs、ICAM-1、VCAM-1等)都参与AS斑块的形成和进展8。已有的研究表明在AS斑块处NF-B明显活化,并且其活化程度与AS病变程度正相关。二甲双胍是国际糖尿病联盟(IDF)指南中推荐的2型糖尿病患者降糖药物治疗的基石,广泛应用于临床。它减少肝脏葡萄糖异生及肝糖输出,近来还发现具有增加纤溶、抑制PAI-1、调节脂质代谢、改善内皮功能、减少糖基化终末产物等作用9。既往动物和临床试验已表明二甲双胍具有显著的抗动脉粥样硬化的特性4,但具体机制尚不明确,上述各种作用都可能参与其中。图5各组家兔血管壁细胞NF-B p65和IB蛋白含量本实验通过免疫损伤加高脂饮食的方法建立了家

16、兔的动脉粥样硬化模型,并采用高频超声探查的方法验证建模成功。低密度脂蛋白胆固醇浸润到血管内膜,造成内皮损伤,始动损伤免疫炎症反应,经内皮细胞氧化修饰的低密度脂蛋白胆固醇活化血管内皮细胞、平滑肌细胞及单核巨噬细胞中的NF-B10,而启动相应免疫炎症基因的表达。在AS组家兔可以观察到主动脉血管壁中IB明显降解,而胞核中NF-B的表达量显著增加,同时伴有血清中炎症指标hs-CRP浓度的增加。hs-CRP不仅是心血管疾病的危险标志之一11,而且通过多种途径直接参与了AS的进程。本实验发现二甲双胍干预(150 mgkg-1d-1)能够减缓高脂饮食所致家兔主动脉粥样硬化病变的进展,显著降低病变部位抑制蛋白

17、IB的降解和NF-B的活化,并使得血清hs-CRP水平降低,揭示二甲双胍可能具有抑制慢性炎症反应的功能。慢性低度炎症状态目前被认为是2型糖尿病和动脉粥样硬化性疾病的共同土壤之一12,对其中的免疫炎症机制进行干预成为目前研究的一个热点。国外有临床试验显示,糖耐量异常(IGT)和2型糖尿病患者接受二甲双胍治疗可以降低血清中可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)、血管细胞粘附分子-1(sVCAM-1)和E-选择素等炎症介质水平,而且这种作用与血糖控制水平无关13, 14。新近又有学者发现二甲双胍可以通过剂量依赖性地抑制NF-B的活化而减弱IL-/TNF-诱导的培养皿中血管壁细胞(EC、单核细胞等)炎症细胞因子的表达,提示其具有直接的抗炎作用,进一