总RNA提取实验原理

1、总RNA提取实验原理、步骤和问题解答Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。无论是人、动物、植物还是细菌组织,各种样品最大使用量(1ml Trizol,动物组织( 50mg,植物组织(100 mg

2、,丝状真菌( 100mg,动物细胞(5×1061×107,酵母(1×107 。TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如,从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色,可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带,(mRNA和hnRNA 成分两条优势核糖体RNA条带位于5 kb (28S和2 kb (18S,低分子量RNA介于0.1 和0.3 kb之间(tRNA, 5S。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值1.8 。实验用品【实验耗材】1、移液枪:1ml、200l、20l、10l、2l。酒精擦拭,头部重点

3、,紫外线照射。2、吸头:1ml、200l、20l3、匀浆管:5ml4、吸头台:放置1ml吸头的一个,放置20l吸头的一个5、EP管:1.5ml、0.2ml、100l6、试剂瓶:2个60ml的棕色广口试剂瓶。青霉素小瓶(分装无水乙醇,高压的DEPC水,-20°C保存。7、量筒:50ml、250ml、500ml8、容量瓶:250ml、500ml、1000ml9、试管架:5ml、1.5ml、20l10、盐水瓶:250ml、500ml各2个备用,一个装无水乙醇,另一个装DEPC水11、铝制饭盒:4个12、塑料小饭盒:1个13、大瓷缸:2个14、锡泊纸:一卷15、卷纸:2卷16、三角烧瓶:带盖

4、,稍大(融琼脂糖【实验仪器】天平、振荡器、高速离心机、0.510ul、20200ul、1001000ul加样器。【自备试剂】DEPC(焦碳酸二乙酯,氯仿,异丙醇,无水乙醇,0.050.1%DEPC-H2O,75%乙醇,TE缓冲液,琼脂糖。RNA抽提的准备工作【试剂配制】1.DEPC水:1ml+1000ml双蒸水=1 DEPC水,1000ml容量瓶中静置4小时。2.75%乙醇:无水乙醇+DEPC水,-20保存(DEPC水需先高压3.氯仿:棕色瓶4.异丙醇:棕色瓶【器具处理与准备】1.塑料制品:(包括枪头、EP管、匀浆管等先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中,将塑料制品逐个浸泡其中,小枪头需打入DE

5、PC水,室温过夜,高压,烤干备用,实验前将枪头等放入吸头台,再高压一次(EP管。胶塞同样处理。塑料器皿也可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。2.玻璃制品:泡酸过夜,冲洗干净,1 DEPC过夜,蒙锡纸,150°C烘烤4h,180°C,2h。或泡酸过夜,冲洗干净后高温烘烤,1 DEPC过夜,高压。盛装乙醇,DEPC水用。3.匀浆器:(包括剪刀、镊子先洗净后,再高压(不需要泡DEPC实验内容和方法一、抽提(一组织抽提1.组织取材后用灭菌的锡箔纸包好保存于液氮。实验时,在液氮中将组织研磨成粉末,趁液氮未挥发将粉末转移到EP管,室温5000rpm离

6、心去上清。每50-100mg组织,加入1ml Trizol。2.若是新鲜标本经匀浆后转移离心管,加入1ml Trizol。3.若组织量(110 mg或细胞数很少(102104,在样品中加入800 ul Trizol反复抽吸均匀,再加入糖原(终250ug/ml,剧烈振荡或用匀浆器匀浆。4.在匀化后和加入氯仿之前,样品可以在6070°C保存至少一个月。(二细胞抽提1.倒掉培养基,PBS洗,直接将1ml Trizol 注入培养瓶(5×106,反复抽吸均匀。2.或收集细胞后加入Trizol 反复抽吸均匀。二、分相4. 12000 rpm 15分钟4°C,分相为三层。上层:

7、RNA(约为Trizol的60%;中间:DNA;下层:蛋白质(酚-氯仿。5.小心吸取上清液,转移到另一EP管中。1ml裂解物产生的上清液体积约为0.40.6 ml。有机相和中间层含有DNA和蛋白质,避免触及。三、RNA沉淀7.离心12000rpm 10分钟4°C。8. RNA沉淀将在离心底的侧面形成。小心吸弃上清液,注意避免吸弃RNA沉淀。四、RNA清洗9.离心管加入1ml 预冷的75%乙醇(1mlTrizol至少1ml乙醇清洗DNA,振荡混均30秒,使沉淀振荡起来,室温12000rpm×12分钟。(有文献称不超过7500g离心。尽可能吸弃上清液,防止RNA沉淀丢失。重复以

8、上清洗步骤一次。在75%乙醇中,RNA在4至少保存1周,-20至少保存1年。10.室温选择流动性小,倒置离心管于滤纸上,干燥RNA,但不能完全干燥(510分钟。用DEPC水15l 溶解沉淀,55-60孵育1015分钟。11.测量OD值后,样品放置-70保存,一个月五、RNA、DNA浓度的计算取78l DEPC水加2l 第10步液体,则稀释倍数为40倍。【RNA】=A260 X 40 X n/1000g/l【DNA】=A260 X 50 X n/1000g/l(n为稀释倍数分离RNA的理想效果是A260/A280=1.82.0A260代表RNA OD值;A280代表蛋白OD值注意事项1. RNA

9、产量:每1 mg组织或1×106培养细胞预期的RNA产量(1肝和脾,610g(2肾,34g(3骨骼肌和脑组织,11.5g(4胎盘,1-4g(5上皮细胞(1×106 ,815g cultured cells(6纤维母细胞(1×106 ,57g cultured cells2.电泳检测: 制备甲醛变性,1%琼脂糖凝胶快速电泳,25ug/lane,65V,2.5h,检测RNA分子完整性,观察18S、28S条带。3. RNA沉淀完全干燥,会极大地降低可溶性。部分溶解的RNA其A260/280比值&1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶解RN

10、A,并在5560°C下孵育10分钟,当RNA以后要用于酶切反应时,避免使用SDS。对于胰腺,肾等组织中RNase含量很高,沉淀用100%去离子甲酰胺溶解,70°C保存。4.分离RNA的理想效果是A260/A280=1.82.0【分离胶范围】<500bp 1.21.5%>10 kp 0.30.7%二者之间0.81.0%【分析和定量】紫外分光光度计测定A260及A280来定量分析RNA的纯度及浓度。用什么稀释的RNA,就用其调零。5.预防RNA酶污染6.在分相步骤吸取上清液过程中,和清洗步骤吸弃上清液过程中,都应在不触及其他相或沉淀的前提下吸取尽可能多的上清液。7.

11、台式离心机最大能达到2,600×g的离心力,如果将离心时间延长到30-60分钟可以满足操作。8.当TRIZOL用量少于2ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。TRIZOL用量较大时,可以使用玻璃试管(Corex或聚丙材质试管,事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。离心前小心平衡试管。离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口,聚丙烯管必须盖紧。9. 用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。【疑难解答】一、无RNA沉淀1. 匀浆不完全:匀浆不完

12、全时,基因组DNA分子仍然很大,溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成絮状凝集物容易包裹RNA,使之不能有效地释放到溶液中。2.沉淀不完全:从小于2×105动/植物细胞、小于2mg动物组织、小于4mg植物组织或RNA含量低的动/植物组织中提取RNA时,匀浆体积太大,将造成RNA过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时,应按比例减少抽提溶液。二、抽提率低1. 系统超负荷:如果过多增加单位体积内的样品量,将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大,使RNA不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难,降低RNA沉淀效率.

13、2.样品均化或裂解不完全: 匀浆不完全时,RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹,不能被有效释放。3.终RNA不完全溶解:未溶解的RNA丢失。4.样品未及时处理或细胞生长过度:样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活,细胞生长过度同样会激活细胞内RNA酶,若不及时提取RNA,大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取,应立即用液氮冷冻完全,置-80贮存。三、A260/A280 比率&1.651.在分光光度计测量前用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品。低离子强度和低pH溶液会增加280 nm 处的光吸收值。2.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。3.匀浆化后样品没有在室温下放置5分钟。4.分离的水样层中污染有苯酚层。5.终RNA没有完全溶解。四、RNA降解1.从动物体取下的组织没有立即进行抽提或冰冻保存。2.用于抽提的样品,或抽提的RNA样品保存于520°C,而不是存放于70°C。3.细胞经胰酶消化而分散。4.水溶液或试管污染有RNA酶。6. RNA在水溶液中呈酸性,易自发水解,应溶于TE,-20以下保存。?五、DNA污染1.样品匀浆化时所加的TRIZOL量太少。2.用于抽提的样品包含有机溶媒(如乙醇,DMSO,强缓冲液或碱性溶液。六、蛋白多糖和多糖污染下述的对RNA沉淀方法