黄淮海地区夏玉米纹枯病菌的融合群鉴定

1、黄淮海地区夏玉米纹枯病菌的融合群鉴定夏海波 伍恩宇 于金凤*山东农业大学植物病理学系 泰安 271018 基金项目：山东省优秀中青年科学家奖励基金项目（No. 2004BS016）；公益性行业科研专项（No. hyhyzx07-049）*Corresponding author. E-mail: jfyu收稿日期：2007-11-12，接受日期：2008-01-11摘 要：从黄淮海地区采集玉米纹枯病标样250余份，分离得到176个丝核菌菌株。融合群测定及5.8S rDNA-ITS区序列分析结果表明，这些菌株分别属于多核丝核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG4-HG-I、AG-5、WAG-Z融

2、合群及双核丝核菌的AG-A、AG-Ba融合群。其中AG1-IA是优势融合群，占分离菌株总数的64.20%，其次是AG-Ba，占12.50%，再依次分别是WAG-Z（10.23%）、AGI-IB（5.11%）、AG-4-HG-I（3.98%）、AG-5（2.27%）和AG-A（1.70%）。其中AG-Ba融合群是国内首次在玉米上分离得到。从各融合群中选取代表性的菌株进行5.8S rDNA-ITS区序列分析结果表明，隶属不同融合群或亚群的菌株其5.8S rDNA-ITS区序列存在较大的差异，而相同融合群（或亚群）不同菌株之间其序列的一致性可高达97%-100%。关键词：立枯丝核菌，融合群，5.8S

3、 rDNA-ITS区序列分析The anastomosis groups of the corn sheath blight pathogen Rhizoctonia spp. in Huanghuai Plain and Haihe Plain of ChinaXIA Hai-Bo WU En-Yu YU Jin-Feng*Department of Plant Pathology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, ChinaAbstract: One hundred and seventy-six isolates were

4、obtained from corn sheath blight samples in Huanghuai Plain and Haihe Plain (including Shandong, Henan, Hebei Provinces and Northern regions of Jiangsu Province) of China. Anastomosis group identification and 5.8S rDNA-internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis showed that the isolates belo

5、nged to multinucleate Rhizoctonia AG1-IA, AG1-IB, AG4-HG-I, AG-5 and WAG-Z and binucleate Rhizoctonia AG-A and AG-Ba. Of these, AG-1-IA was the major anastomosis group(AG)（64.20% of total isolates), followed by AG-Ba (12.50%), WAG-Z (10.23%), AG1-IB (5.11%), AG4-HG-I (3.98%), AG-5 (2.27%) and AG-A (

6、1.70%). AG-Ba was isolated for the first time from maize in China. 5.8S rDNA-ITS sequence analysis showed that the isolates could be distinctly separated based on their AG types. The isolates belonging to the same AG (or sub-AG) showed 97%-100% sequence identity.Key words: Rhizoctonia solani, anasto

7、mosis group, 5.8S rDNA-ITS sequence随着紧凑型玉米品种的大面积种植，玉米栽培密度提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米纹枯病发生的小气候条件。自80年代以来，该病在一些地区为害日益严重，成为玉米上的一种重要病害(梁继农等 1997；唐朝荣等 2000)。我国不同玉米种植区引起玉米纹枯病的丝核菌的融合群不同（高卫东 1987；唐朝荣等 2000；李华荣和兰景华 1997；肖炎农等 2002）。但引起典型症状的主要是立枯丝核菌Rhizoctonia solani AG1-IA群。黄淮海地区是我国夏玉米主产区，玉米纹枯病对该地区玉米的危害呈逐年加重的趋势，目前国内尚无人

8、对该地区玉米纹枯病菌的融合群类群进行系统研究。本研究旨在利用融合群鉴定手段和5.8S rDNA-ITS区序列分析方法确定黄淮海地区夏玉米纹枯病菌的融合群类群，为有效控制玉米纹枯病的危害，特别是为抗病品种的选育提供基础资料。1 材料与方法1.1 供试菌株的采集和鉴定2004-2007年，从山东、河南、河北三省及江苏北部地区夏玉米产区采集玉米纹枯病罹病叶鞘、苞叶、菌核，采用常规组织分离法分离菌株。分离、纯化后获得的纯培养物分别保存在4的PDA试管斜面上，备用。1.2 菌丝融合群测定菌丝融合群测定所用的标准菌株（属于日本系统）由中国农业大学唐文华教授和云南农业大学杨根华教授提供。融合群测定是采用玻片

9、对峙法，按Zhang & Dernoeden (1995)的方法进行。融合群鉴定采用Sneh（1991）的融合标准：1、完全融合：接触细胞的细胞壁溶解，细胞质融合，互有引诱现象。2、不完全融合：接触细胞间细胞壁溶解，某一细胞内细胞质流入另一细胞内，且造成双方融合及其邻近几个细胞发生畸形，原生质减少或消失，有杀死反应，一方引诱另一方。3、接触融合：接触细胞壁不溶解，接触的两细胞无异常反应，各自菌丝按原来方向继续生长，属于前两种情况的菌丝融合方式视为相同融合群。1.3 供试菌株DNA的提取从融合群鉴定确定是隶属7个不同融合群的菌株中分别随机选取1-3个菌株，共计11个菌株（见表1）作为各融

10、合群的代表菌株。各菌株在PDA平板上活化3天后，切取4mm小块转移至PD液体培养基中，振荡培养（25、80r/min）7d。7d后将菌丝过滤烘干，采用卢圣栋（1999）的方法提取各供试菌株的全基因组DNA。1.4 PCR扩增和 5.8S rDNA-ITS区序列测定选用50L反应体系，各组成成分如下：32.5L双蒸水；5.0L 10×PCR缓冲液；4.0L MgCl2 (25mol/L)；4.0L dNTP (dATP, dCTP, dGTP和dTTP各2.5mol/L)；引物ITS1和ITS4（浓度为25mol/L）各1L；模板DNA 2.0L；Taq酶（5U）0.5L。扩增反应共3

11、0个循环，条件为94变性1min，60退火1min，72延伸 2min。扩增结果用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，TBE为电泳缓冲液，上样5L。PCR扩增产物回收后由北京博尚生物技术有限公司进行测序。以ITS1和ITS4作为测序引物，进行正反方向的双向测序。每一序列用DNACLUB软件对正向（5¢-3¢）和反向(3¢-5¢)序列进行核对并生成5¢-3¢的完整序列。用Bioedit软件进行多重序列比较，MEGA3.1软件构建供试菌株的系统发育树。表1 11个测序菌株的来源及其融合群归属Table 1 Locality and anastomo

12、sis group of the eleven isolates used for sequencing菌株Isolates来源Source核数Nucleus number融合群Anastomosis groupYWK-3山东泰安 Taian, Shandong多核 multinucleateAG1-IAYWK-31山东泰安 Taian, Shandong双核 binucleateAG-BaYWK-42山东泰安 Taian, Shandong双核 binucleateAG-BaYWK-63山东蓬莱 Penglai, Shandong多核 multinucleateWAG-ZYWK-72河北保定

13、 Baoding, Hebei多核 multinucleate AG1-IBYWK-83河北沧州 Cangzhou, Hebei双核 binucleateAG-AYWK-85河北沧州 Cangzhou, Hebei双核 binucleateAG-AYWK-92山东泰安 Taian, Shandong多核 multinucleateAG4-HG-IYWK-112河南西华 Xihua, Henan双核 binucleateAG-BaYWK-120河南临颍 Linying, Henan多核 multinucleateAG1-IAYWK-130河南安平 Anping, Henan多核 multinuc

14、leateAG-52 结果与分析2.1 黄淮海地区夏玉米纹枯病菌的融合群组成和分布采自山东、河南、河北三省及江苏北部地区的250多份玉米纹枯病标本中共分离、纯化获得176个丝核菌菌株（表2）。融合测定结果表明，176个丝核菌菌株可划分为7个融合群，113个菌株属于AG1-IA融合群，其中11.5%的菌株与标准菌株间为完全融合（见图1），另外88.5%的菌株与标准菌株间为不完全融合（见图2）。9个属于AG1-IB融合群的菌株中有88.9%为不完全融合。7个属于AG4-HG-I融合群的菌株中有85.7%为不完全融合。4个属于AG-5融合群的菌株均为不完全融合。18个属于WAG-Z融合群的菌株中有8

15、3.3%为不完全融合。3个属于AG-A融合群的菌株中有66.7%为不完全融合。22个属于AG-Ba融合群的菌株中有90.9%为不完全融合。由表3可以看出，黄淮海夏玉米纹枯病菌是由多核丝核菌的AG1-IA、AG1-IB、AG4-HG-I、AG-5、WAG-Z融合群及双核丝核菌的AG-A、AG-Ba融合群构成，其中AG1-IA群出现频率最高，占全部菌株的64.20%，为优势融合群。其次是AG-Ba，占12.50%。由表3还可以看出，AG1-IA为四省份玉米纹枯病的优势致病群，而其他融合群的分布在不同地区间存在一定的差异。如AG-Ba融合群在河南省获得的菌株数量较多，在山东及河北的数量相对较少，而在

16、江苏北部地区没有分离到。因此AG-Ba融合群的分布及致病力问题有待于进一步研究。表2 菌株的来源及数量Table 2 Locality and number of all isolates来源Source 数量Number来源Source数量Number山东泰安 Taian, Shandong8河北景县 Jingxian, Hebei1山东潍坊 Weifang, Shandong5河北邯郸 Handan, Hebei3山东文登 Wendeng, Shandong5河南民权 Minquan, Henan8山东蓬莱 Penglai, Shandong3河南西华 Xihua, Henan5山东海阳

17、Haiyang, Shandong3河南淮阳 Huaiyang, Henan4山东博兴 Boxing, Shandong 3河南临颍 Linying, Henan6山东曹县 Caoxian, Shandong5河南安平 Anping, Henan3山东滕州 Tengzhou, Shandong4河南登封 Dengfeng, Henan4山东枣庄 Zaozhuang, Shandong5河南温县 Wenxian, Henan3山东曲阜 Qufu, Shandong3河南许昌 Xuchang, Henan3山东德州 Dezhou, Shandong4河南商丘 Shangqiu, Henan3山东禹

18、城 Yucheng, Shandong5河南禹州 Yuzhou, Henan3山东肥城 Feicheng, Shandong3江苏东海 Donghai, Jiangsu3山东聊城 Liaocheng, Shandong5江苏邳州 Pizhou, Jiangsu3山东烟台 Yantai, Shandong5江苏泗阳 Siyang, Jiangsu5河北衡水 Hengshui, Hebei1江苏五港 Wugang, Jiangsu1河北保定 Baoding, Hebei9江苏徐州 Xuzhou, Jiangsu7河北石家庄Shijiazhuang, Hebei6江苏涟水 Lianshui, Jia

19、ngsu2河北沧州 Cangzhou, Hebei3江苏灌云 Guanyun, Jiangsu4河北廊坊 Langfang, Hebei2江苏连云港 Lianyungang, Jiangsu2天津 Tianjin2江苏灌南 Guannan, Jiangsu3河北河间 Hejian, Hebei2江苏睢宁 Suining, Jiangsu3河北邢台Xingtai, Hebei2江苏淮安 Huaian, Jiangsu2河北阜城 Fucheng, Hebei2纵观四省玉米纹枯病菌的融合群分布可以看出，来自山东的玉米纹枯病菌，其融合群的类型最多，可分为6个类型，在已鉴定的7个类型中，只有AG-A融合

20、群的菌株没有分离到。其次是来自河北的玉米纹枯病菌，被分为5个类型，在鉴定的7个类型中，AG4-HG-I 及AG-5融合群的菌株没有被分离到。来自河南及江苏的玉米纹枯病菌均被分为3个类型，除AG1-IA是它们共同拥有的融合群外，其他两个融合群也各不相同。说明引起玉米纹枯病的病原菌其融合群的类型与地理位置存在一定的关系，但AG1-IA融合群在各地均是优势致病群。 图1 YWK-96与标准菌株AG1-IA完全融合 图2 YWK-186与标准菌株AG1-IA不完全融合Fig. 1 Perfect fusion between YWK-96 and AG1-IA. Fig. 2 Imperfect fu

21、sion between YWK-186 and AG1-IA.表3 黄淮海夏玉米纹枯病丝核菌融合群的构成和分布Table 3 Distribution and constitution of Rhizoctonia spp. from corn sheath blight in Huanghuai Plain and Haihe Plain融合群Anastomosis group出现频率%Frequency分布Distribution总计Total山东Shandong河南Henan河北Hebei江苏北部地区Northern regions of JiangsuAG1-IA64.2050241

22、623113AG1-IB5.1120709AG4-HG-I3.9860017AG-52.2722004AG-A1.7000303AG-Ba12.503163022WAG-Z10.233041118总计 Total100.00664233351762.2 供试菌株5.8S rDNA-ITS序列分析从隶属不同融合群的菌株中随机选取11个菌株（表1）作为玉米纹枯病菌7个不同融合群的代表菌株，测定其5.8S rDNA-ITS区序列。将测得的11个菌株的5.8S rDNA-ITS区序列在NCBI中进行BLAST分析，得到与这些菌株亲缘关系最近的标准测试菌株序列，进一步明确了这些菌株的分类地位。利用Bio

23、edit软件对供试菌株及标准测试菌株的序列进行多重序列比较，利用MEGA3.1软件构建系统发育树（图3）。其中DQ307250(AG1-IA)、AB122138（AG1-IB）、AB000031（AG4-HG-I）、DQ355140（AG-5）、DQ102413（AG-A）、AB286931（AG-Ba）和AF222799（WAG-Z）的5.8S rDNA-ITS区序列来源于GenBank，代表7个标准测试菌株的序列。图3 11个供试菌株依据ITS区序列构建的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by analysis of 5.8S rDNA i

24、nternal transcribed spacer nucleotide sequences from eleven isolates of Rhizoctonia spp.由图3可以看出，YWK-92与标准测试菌株AG4-HG-I的一致性为100%，YWK-72与标准测试菌株AG1-IB的一致性为99%，YWK-3和YWK-120与标准测试菌株AG1-IA一致性为100%，YWK-130与标准测试菌株AG-5的一致性为100%，YWK-31、YWK-42、YWK-112与标准测试菌株AG-Ba的一致性为97%-100%，YWK-83和YWK-85与标准测试菌株AG-A的一致性为99%，YW

25、K-63与标准测试菌株WAG-Z的一致性为99%，而不同融合群之间的一致性仅为64%-91%。2.3 黄淮海夏玉米纹枯病菌不同融合群菌株的系统发育关系分析 由图3可以看出，依据各融合群代表菌株5.8S rDNA-ITS区序列的一致性，代表7个不同融合群的菌株可以明显分为三组，第一组主要包括多核丝核菌立枯丝核菌的成员即AG1-IA融合群的代表菌株YWK-3和YWK-120，AG1-IB的代表菌株YWK-72，AG4-HG-I融合群的代表菌株YWK-92及AG-5融合群的代表菌株YWK-130，此4个融合群菌株其5.8S rDNA ITS区序列的一致性为88%-91%；第二组是双核丝核菌的成员，分

26、别是AG-Ba融合群的代表菌株YWK-31、YWK-42、YWK-112和AG-A融合群的代表菌株YWK-85和YWK-83，此两个融合群的代表菌株的5.8S rDNA-ITS区序列的一致性为88%；第三组仅包括多核丝核菌WAG-Z融合群的代表菌株YWK-63。根据5.8S rDNA-ITS区序列的一致性还可以看出，第一组和第二组不同融合群的代表菌株其一致性为84%，而WAG-Z融合群的菌株与此两组菌株序列的一致性仅为64%，说明多核丝核菌WAG-Z融合群的代表菌株与同为多核丝核菌的立枯丝核菌不同融合群菌株间的系统发育关系较远。3 讨论玉米纹枯病的病原种类构成，由于样本来源或发生地的不同，存在

27、着一定的差异。菲律宾报道只发现AG1-IA（Pascual et al. 2000）。Demirci & Kordali（1999）从土耳其黑海沿岸地区的玉米病穗上分离到AG-4，AG-5，AG-10，AG-Ba和WAG-Z。我国不同玉米种植区玉米纹枯病菌的融合群也不相同。高卫东（1987）报道在华北地区从玉米罹病叶鞘中分离出AG1-IA、AG1-IB、AG-3、AG-5、CAG-3、CAG-6、CAG-8、CAG-9和CAG-10等多个融合群，其中AG1-IA是主要融合群。四川玉米纹枯病的主要病原有AG1-IA、AG-4及WAG-Z（李华荣和兰景华 1997）。江苏省引起玉米纹枯病的

28、病原有AG1-IA 和AG1-IC融合群（陈厚德等 1996）。肖炎农等（2002）自湖北省9个主要玉米产区采集玉米纹枯病标样，分离得到55个丝核菌菌株，融合群测定表明，这些菌株分别属于立枯丝核菌的AG1-IA、AG-4、AG-5及双核丝核菌的AG-A、AG-B(O)、AG-E和多核丝核菌的WAG-Z等7个融合群，其中AG1-IA是优势融合群。综合各地区的研究结果可以看出，在我国，引起玉米纹枯病的优势致病群是立枯丝核菌 Rhizoctonia solani AG1-IA群。本研究以黄淮海地区玉米纹枯病菌为研究对象，发现在黄淮海地区夏玉米上引起玉米纹枯病的病原有AG1-IA、AG1-IB、AG4

29、-HG-I、AG-5、AG-A、AG-Ba和WAG-Z融合群的丝核菌，此结果与肖炎农等（2002）对湖北玉米纹枯病菌的鉴定结果类似。唯一不同的是在黄淮海地区没有发现AG-B(O)融合群的菌株，而是新发现了AG-Ba融合群的菌株，此类群是国内首次在玉米上分离到。另外5.8S rDNA-ITS区序列分析结果进一步确定了供试菌株融合群鉴定结果的可靠性。双核丝核菌AG-Ba融合群最初是作为粟灰疫病病原被报道的。Nakata和Kawamura发现此病原在日本能够引起水稻灰色菌核病（Sneh et al. 1991）。Ogoshi等（1983）依据菌丝融合群分类法把该病原划分为双核丝核菌的AG-Ba融合群

30、。Demirci & Kordali（1999）从士耳其黑海沿岸地区的玉米病穗上分离得到12个AG-Ba融合群的菌株，占其分离菌株总数的30%。我国岳红宾等（1997）从河南玉米地和菜地土壤中分离得到14个丝核菌菌株，经融合鉴定表明14个菌株中有5个菌株属于AG-Ba融合群，但没有经5.8S rDNA-ITS区序列分析进一步确定。本研究在玉米纹枯病罹病组织上分离得到AG-Ba融合群，并利用5.8S rDNA-ITS区序列分析方法确定了融合群鉴定的可靠性。AG-Ba融合群能引起玉米纹枯病在国内尚属首例报道。REFERENCESChen HD, Liang JN, Zhu H, Zhao

31、GD, Liu J, 1997. The anastomosis groups and their sensitivity to fungicides of corn sheath blight in Jiangsu Province. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences, 13(2): 94-98 (in Chinese)Demirci E, Kordali S, 1999. Rhizoctonia species and anastomosis group from corn kernels in Turkey. Plant Disease,

32、83(9): 879 Gao WD, 1987. Studies on etiology of sheath blight of maize, sorghum and millet in North China. Acta Phytopathologica Sinica, 17(4): 247-251 (in Chinese)Li HR, Lan JH, 1997. Identification characteristics of Rhizoctonia zeae from sheath blight of maize. Mycosystema, 16(2)：134-138 (in Chin

33、ese)Liang JN, Chen HD, Zhu H, Liu WJ, Huang YF, Liu J, Zhao GD 1997. Yield loss caused by corn sheath blight and its outbreak regularity. Acta Phytopathologica Sinica, 17 (2): 102-106 (in Chinese)Lu SD, 1999. Current protocols for Molecular Biology.2nd ed. Peking Union Medical College Press, Beijing

34、 (in Chinese)Ogoshi A, Oniki M, Araki T, Ui T, 1983. Studies on the anastomosis groups of binucleate Rhizoctonia and their perfect states. Journal of the Faculty of Agriculture Hokkaido University, 61: 244-260 Pascual CB, Toda T, Ragmrodo AD, 2000. Characterization by conventional techniques and PCR of Rhizoctonia solani isolates causing banded leaf sheath blight in maize. Plant Pathology, 49(1): 108-118Sneh B, Burpee L, Ogoshi A, 1991. Identification of Rhizoctonia species. American Phytopathological Socie