基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器

1、基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器         11-04-23 14:03:00     编辑：studa20                  作者：干宁 王鲁雁 李天华 郑 磊 王 峰【摘要】  在玻碳电极(GCE)表面固定对H2O2有催化还原活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(GC

2、E|CuL);再在GCE|CuL表面修饰一层金磁微粒壳聚糖复合膜(nano Au/Fe3O4/Chit), 进而固定艾滋病毒(HIV)诊断标志物包膜糖蛋白(gp160)抗体(anti gp160), 由此构建了一类快速检测 gp160的无试剂安培免疫传感器。当该传感器在含gp160溶液中37 下温育30 min后, 传感器表面生成的免疫复合物随gp160浓度的增大而增加, 导致CuL 对H2O2 电催化还原效果降低, 催化电流呈现下降趋势。在PBS溶液(pH 7.0)和-300 mV下, 催化电流的降低值Io与gp160浓度在1400 g/L 呈线性关系; 检出限为0.5 g/L(3)。研制的

3、免疫传感器检测gp160时, 一步免疫反应即可得结果, 较相同条件下包被gp160抗体的纳米金单分子层修饰电极灵敏度更高, 检测范围更宽, 有望用于艾滋病人血清标志物gp160快速筛测。 【关键词】  富马酸二甲酯联吡啶铜, 纳米金, 磁性微粒, 壳聚糖, 艾滋病毒，包膜糖蛋白, 安培免疫传感器1 引 言人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期检出对杜绝艾滋病传播极其重要, 常用的艾滋病诊断方式是抗体检测1。在艾滋病毒感染早期, 人体内尚未出现抗体(即 “窗口期”), 已具有很强的传染性2。此时，“窗口期”HIV的诊断标志物包膜糖蛋白抗原(gp160)已经存在于人血清中, 但含量很低(&

4、lt;8 g/L), 若能对其检测将有效缩短诊断“窗口期”3。目前, 主要采用化学发光酶联免疫(ELISA)法检测痕量gp1603, 该法虽然结果准确, 但是操作繁琐、仪器昂贵, 限制了其推广。电化学免疫分析具有操作简便、样品量少、快速灵敏等特点, 已应用于临床检测49。由于缺乏简单而又能长期保持抗体生物活性的电极固定方法, 且通常需要在反应体系中加入电子媒介体(eT)以加速电子传递, 导致基底干扰并使抗体失活, 限制了其应用59。近年来, 通过在金胶等具有良好生物兼容性的纳米颗粒上包被抗体, 并将其与eT共固定到电极表面, 获得了灵敏度高、无需外加eT、且抗体不易失活的无试剂安培免疫传感器1

5、014。He等9通过在电极表面的壳聚糖(Chit)膜上层层电沉积纳米金, 包被癌胚抗原(CEA)抗体, 获得了测定CEA的安培免疫传感器。由于电极表面有多层纳米金, 比单分子层纳米金吸附更多抗体, 因此在检测CEA时线性范围更宽, 灵敏度更高。然而该电极检测需在电解池中加铁氰化钾作eT, 体系复杂，易导致抗体失活, 且电极表面需多步纳米修饰, 操作繁琐。本研究组在单分散Fe3O4微粒表面负载纳米金, 合成了nano Au/Fe3O4金磁性微粒12。在每个Fe3O4微粒表面包裹着多个纳米金, 再接枝到电极表面形成单分子层将比单层纳米金吸附更多抗体, 扩展传感器检测范围, 提高灵敏度。某些铜配合物

6、具有催化H2O2活性, 可代替H2O2酶被修饰在电极表面制作H2O2传感器15。基于以上思路, 本实验合成了对H2O2具有催化活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(CuL)16, 将其与gp160抗体包被金磁微粒壳聚糖复合膜共固定在GCE上, 制备了gp160免疫传感电极, 并用于血清样本检验。        2 实验部分2.1 仪器与试剂CHI660B电化学分析工作站(上海辰华公司);三电极体系：GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(=2 mm)为工作电极, 铂电极为对电极, 饱和甘汞电极为参比

7、电极;Easysizer20激光粒度仪(美国欧美克公司);VF320型X射线荧光光谱仪(日本岛津公司);PHI5400X射线光电子能谱仪(美国PE公司), Hitachi X650扫描电镜(日本Hitachi公司)。直径50400 nm的Fe3O4微粒(美国Fluka公司);3巯丙基三乙氧基硅烷(95%)、壳聚糖(Chit, 脱乙酰度>90.0%)及AuCl3·HCl·4H2O购自上海国药试剂公司。人抗人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)ELISA试剂盒(美国ADL公司)：包括不同浓度(0500 g/L)的gp160抗原和单克隆gp160抗体(Anti gp160);牛血清

8、蛋白(BSA, 96%99%)与人血清蛋白(HSA, 96%99%)购自美国Sigma公司。其它试剂均为分析纯, 实验用水为超纯水(美国Millipore纯水器)。2.2 Nano Au/Fe3O4/Chit共聚物合成按文献16合成富马酸二甲酯联吡啶铜(Cu(bpy)2(H2O)2(C6H8O4)2(ClO4)4)。Nano Au/Fe3O4溶胶参考文献1012合成, 用粒度分析仪和TEM测得金磁微粒直径为(280±1.2) nm, 纳米金粒径为(30±1.7) nm, 浓度为5×107粒/mL。根据X射线能谱分析, 颗粒表面Au和Fe的质量分数分别为23.7%和

9、40.2%, 估算出每个Fe3O4包被1020个金胶。Nano Au/Fe3O4/Chit溶胶参考文献10方法制备：将1 mL Nano Au/Fe3O4溶胶与2 mL 0.1%壳聚糖0.05 mmol/L HAc混合，搅拌2 h, 在4 下放置过夜。2.3 GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 电极的制备和检测将玻碳电极浸于1.0 mmol/L CuL二甲苯溶液中,10 h后取出, 以二次蒸馏水反复冲洗去除电极表面杂质, 自然干燥, 制得 GCE|CuL 电极15。按照文献9方法, 取10 L nano Au/Fe3O4/Chit溶液滴在GCE|CuL电

10、极表面形成一层稳定膜, 室温晾干, 进而将其浸入anti gp160溶液中于25 放置7 h, 即得GCE|CuL/nanoAu/Fe3O4/Chit/anti gp160免疫电极。再将此电极浸入5%BSA溶液中5 h, 封闭抗体未包被的电极表面, 制备过程见图1。实验中始终维持N2气氛。2.4 测定过程本免疫分析是基于免疫结合物的生成阻碍CuL与H2O2之间的电子传递而进行测定。参照文献14方法, 首先分别测定在5 mL 除氧的0.1 mol/L PBS 溶液(pH 7.0)和含1 mmol/L H2O2 的相同底液中, 免疫传感器在-300 mV 下电解120 s时的安培响应i0和iH。将

11、免疫传感器在含待测gp160的溶液中于37 下温育30 min, 在同样条件下测定含1 mmol/L H2O2的PBS 溶液(pH 7.0)中的安培响应i, 计算安培响应的降低百分率100×(iH-i)/(iH-i0)。         3 结果与讨论3.1 HIV免疫传感器的表征采用交流阻抗谱对电极修饰过程进行了表征。如图2所示, 裸GCE上FeCN高频区的Ret较小。随着CuL, Chit, nano Au/Fe3O4/Chit膜不断修饰到GCE后(图2 bd), 高频区半圆直径不断增大, 表明抗体修

12、饰膜的形成阻碍了FeCN电化学反应。 图2 免疫传感器制备过程中不同电极的交流阻抗图Fig.2 AC impedance plot of(a) bare GCE(b) GCE|CuL(c) GCE|CuL/Chit(d) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(e) the electrode of(d) closed by BSA in 5 mmol/L Fe(CN)3-/4-6+0.5 mol/L KCl solution. The frequency range was 0.1-1.0×105 Hz采用SEM对包被抗体前后的电极表面进行了表征

13、。图3a显示电极表面有许多白色亮点, 推测是nano Au/Fe3O4反射形成的14;当 anti gp160 包被后, 电极表面形态发生了明显变化, 出现了很多岛型片状物质, 推测是抗体固定在电极表面的形貌(图3b)。图3 (a) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit和已经包被anti gp160电极(b)的扫描电镜图Fig.3 Scan electron microscopic images of GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit(a) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 electrode(b)采用X射线

14、荧光光谱(测定元素范围为9F92U)对免疫传感电极表面进行表征, 显示了Cuk(峰(2=123.7)和Sk(峰(2=110.5), 由于gp160抗体富含甲硫氨基酸3, 说明CuL和anti gp160被修饰到电极表面。对吸附了CuL的石墨片进行了XPS分析, 932.7/954.3 eV处出现了Cu2+的特征峰Cu(2P3/2, 2P1/2), 表明铜离子为+2价。3.2 GCE|CuL和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4修饰电极的伏安行为GCE|CuL修饰电极在PBS(pH 7.0)中的循环伏安曲线如图4A所示。由图4A(a)可知, 在扫描速度100 mV/s时, CuL有一对稳定

15、的氧化还原峰, 峰电位分别为14和-310 mV。在底液中加入1 mmol/L H2O2后, 还原峰增大而氧化峰减小(图4A(b), 说明GCE|CuL可催化H2O2的还原。在GCE|CuL上修饰Fe3O4微粒后, 电极在PBS中的氧化还原电流显著提高(图4A(c), 而GCE|CuL修饰nano Au/Fe3O4后电流增强更明显(图4A(d)。文献17, 18报道纳米Fe3O4和纳米Au均有增强GCE表面电子传递功能, 并可提供抗体维持活性的微环境。本实验发现两者形成复合微粒后, 这种增强效应具有可叠加性。GCE|CuL在50300 mV/s扫速范围内, 阳极和阴极峰电流均随扫速增大而增加,

16、 并呈线性关系(图4B), 表现出明显的表面控制过程。由不同扫速下阴极与阳极峰的电位差可计算获得该过程的平均电子传递速率为(1.57±0.12) s-1。CuL表面覆盖度为(9.02±1.13)×10-10 mol/cm2, 这一数值相当于电极表面覆盖的为单分子层13。计算得反应电子数n=1.772, 表明电极表面发生了Cu/Cu(0)的电子转移。图4 (A) GCE|CuL电极在0.02 mol/L PBS(pH 7.0)底液中(a)和加入1 mmol/L H2O2后(b);GCE|CuL/Fe3O4电极(c)和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 电极(

17、d)在相同底液中的循环伏安图; (B) GCE|CuL电极在不同扫速下的的循环伏安图Fig.4 (A) Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME not add(a) and added 1 mmol/L H2O2(b); GCE|CuL/Fe3O4(c) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 CME(d) in 0.02 mol/L PBS(pH 7.0) at scan rate of 100 mV/s. (B) Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME at different scan rate, af: 50, 1

18、00, 150, 200, 250 and 300 mV/s, respectively. 插图(Insert): ipv3.3 免疫传感器的电化学行为及对gp160检测图5a为裸电极在底液中循环伏安(CV)图, 没有任何电流响应。图5b为该免疫传感器在底液中CV图, 和相同扫速下的GCE|CuL相比(图4a), 氧化峰电位正移而还原峰电位负移。由实验可知nano Au/Fe3O4, Chit, anti gp160均无电活性, 故氧化还原峰对应于CuL的氧化还原反应可逆性下降, 可归因为Chit和anti gp160均不导电且分子较大, 阻抗增加, 显著阻碍了CuL的电子传递效率。当在底液中加入1 mmol/L H2O2后, 还原峰增大, 氧化峰减小, 峰电位不变(图5c), 将电极在0.2% HSA中温育后, 电流无明显变化(图5d