利用噬菌体抗体库技术制备抗甲状旁腺激素相关蛋白Fab小分子抗体

1、    利用噬菌体抗体库技术制备抗甲状旁腺激素 相关蛋白 Fab 小分子抗体        【摘要】目的利用噬菌体抗体库技术制备抗甲状旁腺激素相关蛋白(PTHrP)Fab 抗体。方法从经PTHrP免疫的Balb/C小鼠脾细胞提取总RNA，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增一组g轻链和重链Fab段基因，插入噬菌体载体pComb3，构建了抗PTHrP Fab抗体基因库。用合成短肽和重组PTHrP对抗体库进行了富集筛选，获得鼠源抗PTHrP F

2、ab 段基因后，进一步在大肠埃希菌表达，并对表达产物的特异性作了鉴定。结果成功构建了抗PTHrP抗体基因库，且筛选到PTHrP特异的鼠源单抗Fab段基因。结论所获得的Fab抗体能特异性地识别PTHrP抗原。【主题词】甲状旁腺激素相关蛋白；表达；大肠埃希菌；噬菌体呈示；Fab段 Generation of monoclonal antibody Fab fragments to parathyroid hormone related protein by phage display technologyDOU Liqiang LIANG MifangAN Nailiet al（Institute

3、 of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052,China）【Abstract】ObjectiveTo develop monoclonal antibody Fab fragments using display technique.Methods The mouse IgG Fab genes of heavy and light chains were amplified from spleen cells of a parathyroid hormone-relaed protein(PTHrP)

4、 immunized mouse.The combinatorial phage antibody library was prepared by inserting both heavy and light chain Fab genes into phagemid vector pComb3 and followed by infection of helper phage. The library was selected by purified recombinant PTHrP.ResultsThe combinatorial phage antibody library was c

5、onstructed successfully and the specific mouse Fabs to PTHrP were delected and expressed in E.coli.ConclusionThe selected specific mouse Fabs can recognize PTHrP with high specificity.【Key words】Parathyroid hormone-related protein;Expression;E.coli.;Phage display;Fab fragment恶性高钙血症是肿瘤病人常伴有的症状，甲状旁腺激素

6、相关蛋白(Parathyroid hormone related protein, PTHrP)是引起这一现象的原因1。近年来发现PTHrP的过量表达与肿瘤骨转移的病理过程有关，如PTHrP在乳腺癌细胞株MDA-231中的高表达可以增加乳癌溶骨性破坏的发生，而应用抗-PTHrP的单克隆抗体可明显地减少动物模型中肿瘤溶骨性骨转移的发生2，3，可见用单克隆抗体阻抑PTHrP的活性对治疗恶性肿瘤的骨转移很有希望。但是，用常规杂交瘤细胞技术获得的单抗稳定性差，长期传代后基因易丢失，制备成本亦较高。运用噬茵体表面呈现技术(Phage dispiay)构建噬菌体抗体库直接获得鼠源基因工程单克隆抗体，耗时短

7、，耗费小，从建立的抗体库中可以获得任意目的单抗，容易获得高亲和力的中和单抗，能在基因水平改进抗体的特异性和亲和力，并能控制抗体的表达水平4。我们利用噬菌体抗体库技术获得了抗-PTHrP鼠源Fab抗体基因，并在大肠埃希菌中得到表达。1材料和方法1.1质粒和菌株大肠埃希菌XLI-Blue购自美国Stratagene，载体pComb3由美国Scripps研究所惠赠。1.2抗原的制备及免疫根椐氨基酸序列资料5合成了PTHrP与受体结合功能区PTHrP(14-36)。重组PTHrP表达菌株pET-3a/PTHrP由病毒基因工程国家重点实验室构建6，表达产物形成包涵体。将包涵体纯化后溶于样品缓冲液，上样到

8、制备型SDS-PAGE(15%)。电泳结束后把凝胶浸泡在预冷的0.1 mol/L KCl中染色35 min后，切下所需片段，放入透析袋，电洗脱过夜，经透析浓缩每次50 g腹腔注射Balb/C小鼠两次，取脾前3 d用同样剂量的抗原尾静脉注射作加强免疫。1.3鼠IgG Fab基因的扩增采用TRIZOL试剂盒提取脾细胞总RNA，以Oligo dT 为引物逆转录合成cDNA，然后用一组小鼠IgG Fab 重链和轻链的引物7，PCR扩增小鼠IgG轻链和重链Fab段基因。反应条件为：94 1 min,52 1 min,722 min,共35个循环，最后72延伸10 min。1.4噬菌体抗体库的建立将不同引

9、物合成的PCR产物按重链和轻链分别混合，然后将重链基因插入质粒pComb3的Spe 和Xho 酶切位点之间，将轻链基因插入Xba 和Sac 位点之间，电转XLI-Blue菌。加入2 ml SOC培养液，37振荡培养1 h.然后转入三角瓶，加入10 ml SB-A+(含有20 g/ml氨苄青霉素)，37培养1 h。再加入100 ml新鲜SB-A+，371 h后，加入1012PFU的辅助噬菌体VSC M13，继续在37培养过夜，收集上述细菌培养上清，用4%PEG(相对分子量 8 000)和3%NaCl沉淀噬菌体，重悬于PBS(pH7.2)，分装小管存放于-20。1.5噬菌体抗体库的富集筛选将重组P

10、THrP抗原或合成的短肽用0.1 mol/L pH8.6碳酸氢钠稀释后包被96孔板(25 g/ml),用5%脱脂奶-PBS封闭。每孔加入50 l噬菌体抗体库，37孵育2 h，用TBS洗20次。最后每孔加入50 l甘氨酸-盐酸(pH2.2)洗脱。感染2 ml新鲜制备的XLI-Blue菌，经辅助噬菌体VCS M13感染后进行下一轮筛选。如此重复5轮筛选后，随机挑选10个克隆鉴定插入效率。1.6Fab抗体在原核细胞中的可溶性表达选择阳性克隆，提取质粒DNA。取 1 g质粒用Spe 和Nhe 酶切消化去除基因g ，再将质粒自身连接，转化XLI-Blue。取上述菌种接种4 ml SB-A+培养液，37过

11、夜培养后，150转种50 ml SB培养液，37培养至吸光度A值(600 nm)为0.2时加入1 mmol/L IPTG,30培养约1012 h，离心后用1/10体积PBS(pH7.4)重悬细菌沉淀，反复冻融3次。离心的上清即含有表达的可溶性Fab抗体。1.7抗PTHrP Fab抗体体外生物学活性的鉴定。1.7.1ELISA用抗 PTHrP单抗0.1 g包被96孔板，加入0.5 g电泳纯化的PTHrP蛋白，再依次加入重组鼠Fab抗体和HRP标记的抗鼠Fab抗体。显色底物为OPD，在490 nm检测每孔A值。1.7.2Western blot在Bio-Rab电转仪上将SDS-PAGE分离的PTH

12、rP蛋白转移到硝基纤维膜，10%脱脂奶4封闭过夜后，加重 组鼠Fab抗体，室温1.5 h后，加酶标记的羊抗鼠Fab，最后加底物避光显色。1.7.3生物学活性检测ROS17/2.8细胞消化后种入24孔板培养板，37孵育24 h后换成含2%FCS的F12培养液，再培养24 h，实验组均加入20 ng/ml的 PTHrP纯品，同时按以下浓度加入重组Fab单克隆抗体：20，10，5，2，0 g/ml，对照组不加PTHrP和抗体，继续培养30 h后。加入H3-TdR l Ci/孔，作用6 h终止反应，微孔滤膜(0.45 m)收集细胞，置液闪瓶计数。2结果2.1鼠源抗PTHrP抗体基因床的建立从PTHrP

13、蛋白免疫的Balb/C小鼠脾脏分离淋巴细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA后，用一组鼠IgG Fab基因的引物，扩增了鼠IgG重链Fd和轻链基因。1显示经纯化后的不同轻、重链PCR产物，约700 bp左右。分别将轻链和链PCR产物，重链PCR产物混合后，分别在Xba /Sac 或 Xho /Spe 位点克隆入噬菌体载体pComb3，加辅助噬菌体VCSMl3感染后噬菌体抗体基因库。重组质粒的构建见2。     1PCR扩增鼠源IgG Fab轻、重链基因Fig.1PCR amplification of the light and heavy chainFa

14、b genes of mouse IgG1:Mixed light chains.2-6:Mixed heavy chains IgG 1.7-8:Mixed heavy chains IgG2a/2b2.2鼠源抗PTHrP抗体基因库的富集筛选采用纯化重组PTHrP蛋白和合成的PTHrP功能区短肽，对上述建立的鼠源抗PTHrP抗体基因库进行了五轮富集筛选。每轮随机取30个克隆作ELISA分析，特异性抗PTHrP的阳性克隆比例逐轮增加。至第五轮阳性率达72%。我们对第五轮随机筛选的10个克隆进行限制性内切酶切鉴定分析，用Xba/Xho 酶切后，有9个克隆显示有重链和轻链基因的插入(可切下约2.2

15、kb的片段)(3)。     2Fab基因在噬菌体质粒pComb3的插入位点Fig.2Insertion site of Fab genes on pComb3 phagemid     M: DNA/Hind ;110:随机挑选的10个克隆3富集筛选抗体库中随机挑选克隆的内切酶分析Fig.3Restriction enzyme analysis of the clones randomly selected from the antibody library after panningM:DNA/Hind mar

16、ker.1-10:Randomly selected clones2.3鼠源抗PTHrP IgG Fab抗体的可溶性表达及鉴定从阳性克隆中选出1个克隆作进一步研究。首先如方法中所述去除载体中的噬菌体外壳蛋白的基因g，变融合蛋白为独立表达的可溶性Fab蛋白。然后对阳性克隆感染细胞的裂解上清进行特异性的鉴定。ELISA结果表明所获得的表达产物能与PTHrP抗原特异结合，并可被抗 鼠IgG Fab抗体所识别。Western blot 结果也同样证明了这一点(4)。用H3掺入法在ROS17/2.8细胞测定生物学活性的结果见5。一定浓度的Fab抗体可显著抑制cAMP水平升高，并呈较好的剂量依赖关系，当F

17、ab的浓度达50 g时，ROS17/2.8细胞H3的掺入量与对照组接近，表明它完全中和了PTHrP的活性，说明我们研制的重组Fab抗体可在体外阻断PTHrP的活性。3讨论PTHrP在介导肿瘤骨转移中充当十分重要的角色。这主要体现在介导肿瘤至少是乳腺癌溶骨性骨转移的发生和发展；调节肿瘤细胞的生长；充当肿瘤细胞的生长因子。在人类几种常见的肿瘤中尤其以乳癌、前列腺癌和肺癌发生率较高，有统计在乳癌，大约70%的病人伴随着骨转移，且该类骨转移的主要病理特征为溶骨性破坏8，所以，研究PTHrP与肿瘤骨转移的关系主要集中在乳癌。近年来，运用免疫化、原位杂交和 RT-PCR 方法皆证明了发生骨转移的乳癌标本中

18、PTHrP的表达量比无转移的病人明显增高，意味着PTHrP在乳癌骨转移中具有重要的作用9-11。有研究表明在一些乳癌细胞株中存在着PTHrP受体的表达。用抗PTHrP的单克隆抗体可明显减少裸鼠骨转移模型中溶骨性骨转移发生12，说明利用单克隆抗体治疗肿瘤骨转移是可行的。     4Western blot检测鼠Fab抗体对重组PTHrP的特异性结合Fig.4Specific antigen binding activity to expressedFab antibody detected by Western blotA：Negative control

19、.B:Recombinant PTHrP     5用3H掺入法检测鼠Fab抗体中和重组PTHrP的能力Fig.5Neutralization of PTHrP bioligocalactivity by recombinant mouse Fab antibody噬菌体表面表达技术始于1985年，近年来发展日趋成熟，已在各个领域获得广泛应用。其特点是通过特异性富集筛选，可以从基因库中扩增出本来为数稀少的特异性基因。pComb3表达筛选系统是一个用于筛选高亲和力抗体的系统4。本文获得的抗PTHrP抗体Fab段基因，在原核细胞中诱导表达后的产物Fab抗体对

20、PTHrP有较强的特异性和中和活性。由于我们已经获得这株鼠中和单抗的基因，可以在基因水平进一步改进，从而获得更高亲和力的抗体。本文获863高技术课题资助(102-08-01-03)作者单位：钭理强（北京，北京医科大学第一医院泌尿外科研究所100034）郭应禄（北京，北京医科大学第一医院泌尿外科研究所100034）梁米芳（中国预防医学科学院病毒学研究所）安乃莉（中国预防医学科学院病毒学研究所）姚立红（中国预防医学科学院病毒学研究所）张智清（中国预防医学科学院病毒学研究所）参考文献1，Philbrick WM, Wysolmerski JJ, Galbraith S, et al. Definin

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