克霉唑药膜微生物限度检查方法的验证试验研究

1、克霉唑药膜微生物限度检查方法的验证试验研究【关键词】 克霉唑； 薄膜过滤法； 抑菌活性克霉唑（Clotrimazole）药膜作为阴道局部外用制剂，中国药典2005（CP2005）年版二部对受微生物污染的微生物限度有明确要求，对具有抗菌活性的药品进行微生物限度检查，首先应排除抗菌活性，经验证试验来确认其抑菌活性是否去除而不影响检验结果，保证检验结果的准确性。2007年11月2008年2月为建立克霉唑药膜微生物限度检查方法，参考中国药典，以试验菌的回收测定为主要方法，测定克霉唑膜制剂在微生物限度检查条件下对细菌、霉菌、酵母菌的代表菌的抑菌活性，并进行方法选择试验1，2；对筛选出的敏感菌选择用离心沉

2、淀与薄膜过滤法联用消除其抑菌活性，经选择试验确定供试液浓度及冲洗条件，按筛选出的方法作3个批号计数方法的验证，对方法进行评价3；对控制菌检查方法进行了验证试验研究，建立克霉唑药膜的微生物限度检查方法。 1 实验材料及仪器 1.1 仪器与样品 -2000型智能集菌仪、多次使用集菌器、一次性薄膜过滤器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、离心机（800型沉淀离心机，上海手术器械十厂）、高压蒸汽灭菌器、电子天平、生物安全柜、生化培养箱等。克霉唑药膜 （ 规格：4mg，贵州德轩堂制药有限公司生产批号：051225、051226、051227）。 1.2 培养基、稀释剂及试剂 营养琼脂、营养肉汤、玫瑰红钠琼

3、脂、改良马丁培养基、胆盐乳糖增菌培养基、溴化十六烷基三甲胺琼脂、亚碲酸盐肉汤、甘露醇氯化钠琼脂、0.9%氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（中国北京三科科技开发公司生产，按CP2005版规定配制及灭菌）1。 1.3 试验用菌种 大肠埃希菌Escherichia coli、金黄色葡萄球菌Staphylocoddus aureus、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、白色念珠菌Candida aibicans、黑曲霉Aspergillus niger、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosaCMCC（B）10104，菌种均来源于中国医学细菌保存中心，均为不超

4、过5代的菌株1。 2 方法 参照CP2005年版二部附录微生物限度检查法中计数方法的验证、控制菌检查方法的验证。 2.1 菌液制备方法 取经（361）培养1618 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌肉汤新鲜培养液，加入0.9%氯化钠溶液或营养肉汤，10倍递增稀释制成50100 cfu/ml菌液，计数备用。取经26 培养2448 h的白色念珠菌的改良马丁液体新鲜培养液，用0.9%氯化钠溶液10倍稀释制成50100 cfu/ml菌液计数，备用。取经26 培养57 d的黑曲霉改良马丁斜面培养物，加适量0.9%氯化钠溶液洗下孢子，取孢子悬液加入0.9%氯化钠溶液10倍稀释制成50100 cf

5、u/ml孢子悬液计数，备用。 2.2 供试液制备方法 取样品100 cm2，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，振摇，使充分分散均匀，即为110供试液； 取上述110供试液10 ml加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分别至50、100、200 ml，即为150、1100、1200供试液。 2.3 敏感菌的确定及细菌、霉菌、酵母菌计数方法选择试验及验证试验方法 为确定克霉唑药膜的敏感菌，选择有效的去除抑菌活性的方法，用CP2005年版平皿稀释法、低速离心沉淀处理供试液与平皿稀释法联用、低速离心沉淀处理供试液与薄膜过滤法联用消除其抑菌活性1，2；对试验菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆

6、菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉进行活菌计数回收试验，从各菌的回收结果确定敏感菌，选择出回收率在70%以上的方法作为有效方法，各试验菌作3个批号验证试验以对方法进行评价。 2.3.1 平皿稀释法1 每皿中分别加入110供试液1 ml、0.2 ml，每皿分别各加入试验菌50100 cfu，立即倾注规定的琼脂培养基1520 ml，每种试验菌平行制备2个皿，置规定温度，培养、计数菌落数作为试验组；不加入供试液，同法测定相应加入的试验菌数，作为菌液组；不加入试验菌，同法测定110供试液1 ml、0.2 ml中的本底菌数作为空白组，计算回收率。回收率（%）=(试验组平均菌落数-空白组平均菌落数)菌液组

7、平均菌落数100%。 2.3.2 离心加薄膜过滤法联用 取供试液10 ml于500 r/min离心45 min，管底离心沉淀物0.25 ml，取出全部上层液混匀，即为供试液，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（冲洗液室温或加热至4045 ）约90 ml中，混匀过滤冲洗，在最后一次冲洗夜中加入试验菌。取膜贴于规定的琼脂培养基，作为试验组，培养、计数菌落数1；在冲洗液中加入与试验组等量试验菌液，过滤，取膜贴于规定的琼脂培养基作为菌液组；不加入试验菌，同法测定供试液中的本底菌数，作为空白对照；计算回收率（同平皿稀释法）。 2.3.3 冲洗方法条件选择 采用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，

8、每个滤器60、8090 ml/次，冲洗量 300 ml、500 ml或800 ml，在最后一次冲洗液中加试验菌液，冲洗液温度为室温、4045 ，按冲洗效果进行选择。 2.4 控制菌检查验证试验 2.4.1 铜绿假单胞菌 取110供试液10 ml，按CP2005年版二部附录微生物限度检查法中铜绿假单胞菌规定的相应方法进行验证。 2.4.2 金黄色葡萄球菌 取110供试液10 ml 500 r/min，离心5 min，取全部上清液加至装有约80 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的滤器中按薄膜过滤法过滤，冲洗3次，100 ml/次，取膜加至相应的增菌培养基100 ml中，以下操作按CP200

9、5年版二部附录微生物限度检查法中金黄色葡萄球菌检查的相应方法进行验证。 3 结果 3.1 敏感菌确定及细菌、霉菌及酵母菌计数方法选择试验 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌用平皿稀释法110供试液，每皿1 ml，前3种细菌的回收率分别为97%、65%、89%，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌无回收，大肠埃希菌、黑曲霉回收率均达到70%以上；每皿0.2 ml金黄色葡萄球菌回收率为118%；枯草芽孢杆菌、白色念珠菌也无回收，因此确定为敏感菌。用低速离心沉淀处理供试液与薄膜过滤法联用消除克霉唑抑菌活性，枯草芽孢杆菌500 r/ min离心5 min，薄膜过滤，冲洗300 ml，取供

10、试液10 ml（浓度110、1100、1200），回收率分别为0、52%、95%，1200可达70%以上；白色念珠菌500 r/ min离心4 min，薄膜过滤。结果见表1。表1 敏感菌确定及消除抑菌活性方法选择试验结果（回收率%） 3.2 验证试验结果 3.2.1 大肠埃希菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌验证结果 前2种试验菌采用平皿法，每皿加入110供试液1 ml；金黄色葡萄球菌用平皿稀释法，每皿加入110供试液0.2 ml，作3个批号样品回收试验，结果见表2。 3.2.2 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌验证结果 根据方法选择结果，枯草芽孢杆菌验证方法采用离心沉淀处理供试液与薄膜过滤法联用，取1200

11、供试液10 ml，500 r/min离心5 min，取全部上清液 表2 大肠埃希菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌验证试验结果(cfu) 注：空白组均为o cfu 加入约90 ml冲洗液中，过滤，60 ml/次冲洗5次，共300 ml，作3个批号样品，结果见表3。 白色念珠菌验证：根据选择结果，离心沉淀处理供试液，用薄膜过滤，冲洗液温度提高至4045 ，冲洗，上清液0.25 ml、0.2 ml冲洗500 ml，回收均能达70%以上。取110供试液10 ml，500 r/min,离心4 min，全部上清液混匀，取0.25 ml过滤，4045 冲洗液每次8090 ml冲洗6次，共 500 ml，3个批号样

12、品分别作回收试验，平行作2个 膜，结果见表3。 表3 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌离心加薄膜滤法验证试验结果注：空白组均为o cfu 3.2.3 稀释剂对照组 由于2种敏感菌计数方法采用离心、薄膜过滤、冲洗，为考察供试液中微生物受影响的程度，作稀释剂对照组回收试验。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入试验菌，浓度为50100 cfu/10 ml；取10 ml与试验组同法离心加薄膜过滤、冲洗，取膜贴于规定的琼脂培养基，测定菌数，为试验组；不作离心加薄膜过滤、冲洗为菌液组，计算回收率，结果均能达到70%以上。 3.2.4 控制菌检查验证试验 结果见表4。表4 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌验证试验结果

13、注：BL增菌液为100 ml；+：生长相应典型菌落或阳性反应； ：无菌生长或阴性反应 4 讨论 4.1 克霉唑为抗真菌药，按CP2005年版规定的验证菌株为试验菌分别作回收，从本组结果看出，平皿稀释法白色念珠菌、枯草芽孢杆菌均无回收，离心加薄膜过滤法110供试液无回收、150为8%，药物对真菌白色念珠菌有很强抗菌活性，对细菌枯草芽孢杆菌也显示较强抗菌作用，即克霉唑药膜抗真菌的敏感菌为白色念珠菌敏感菌、细菌为枯草芽孢杆菌。药物对大肠埃希菌、黑曲霉（采用平皿法）均未显示有抑菌活性，试验中金黄色葡萄球菌采用平皿稀释法回收率均大于70%，显示有一定抑菌活性。 4.2 为消除药物对敏感菌的抑菌活性，采用

14、离心加与薄膜过滤法对2种敏感菌进行了方法条件的选择。 白色念珠菌110、150供试液10 ml经500 r/min离心4 min，膜法冲洗300 ml，回收率为0%、8%；取上清液1 ml室温冲洗300 ml、500 ml、800 ml，均无回收。 冲洗液温度对白色念珠菌回收的影响：由于克霉唑难溶于水，膜法过滤冲洗液温度较低时，药物及辅料溶解不充分截留于膜上药物不能冲洗干净，110供试液上清液0.25 ml试验结果无回收；将冲洗液温度加热提高至4045 冲洗，取上清液0.25 ml、0.2 ml冲洗500 ml回收率均能达70%以上；结合表3对3个批号样品的验证试验结果，该法能有效消除药物对白

15、色念珠菌抗菌活性，回收率均能达70%以上，重现性好。 枯草芽孢杆菌110、1100、1200 3种供试液试验结果：前2种回收均达不到70%；1200供试液可消除其抑菌活性，回收率达70%以上；结合表3对3个批号样品的验证试验结果，该法能有效消除药物对枯草芽孢杆菌抗菌活性，回收率均能达70%以上。 4.3 稀释剂对照组结果：与试验组同法，白色念珠菌、枯草芽孢杆菌在离心加薄膜过滤及冲洗条件下基本不受影响，回收率均能达到70%以上。 4.4 控制菌金黄色葡萄球菌检查方法验证：3个批号验证试验结果均能检出金黄色葡萄球菌，阴性菌对照组结果显示方法专属性好（表4）；表4结果显示铜绿假单胞菌检查方法可按CP

16、2005年版二部附录微生物限度检查法规定的方法检查。 4.5 根据试验研究的结果，建立克霉唑药膜微生物限度检查方法 细菌计数：取 1200的供试液10 ml于500 r/min离心5 min，取全部上清液加至装有约90 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，过滤，60 ml/次，冲洗5次，共300 ml；其它操作按CP2005年版二部微生物限度检查法薄膜过滤法。霉菌、酵母菌计数：取 110的供试液10 ml于500 r/min离心4 min，取出全部上清液混匀作为供试液，取 0.25 ml加至装有约100 ml 45 pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中混匀，过滤，用45冲洗液冲洗6次，8090 ml/次，共500 ml，作4个膜（取样量共1 ml）；其它操作按CP2005年版二部附录微生物限度检查法薄膜过滤法。 计数结果计算：=AK。 ：菌数（cfu/10 cm2）；A细：营养琼脂平板膜上的菌落数或菌落平均数 ；A霉菌、酵母菌：4个玫瑰红钠琼脂平板膜上的菌落总数 ；K：稀释倍数，K细=20，K霉、酵=10。 控制菌检查：铜绿假单胞菌，取110供试液10 ml，按CP2005年版二部微生物限度检查法相应方法检查；金黄色葡萄球菌，取110供试液10 ml，500 r/min离心5 min,取全部上清液，加至装有约90 ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液