杀菌率试验规程

1、Q/KMZJ2008液体洗涤剂杀菌试验规程内部使用）2008年 月 日内部执行质量管理中心实验室1、2、3、4、5、（ 中华人民共和国卫生部 ） （科技出版社）引用标准GB15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准QB/T2738-2005 日化产品抗菌抑菌效果的评价方法QB/T2850-2007 抗菌抑菌型洗涤剂2002 年版 消毒技术规范2001 年版 药品微生物学检验手册杀菌率试验规程1、试验菌、试验温度、作用时间、试液浓度试验菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC 653）8 ，大肠杆菌（ 8099 或 ATCC 2592）2 ，白色念珠菌试验温度： 作用时间： 试液浓度： 菌悬液用量：

2、度、取量相同2、细菌繁殖体悬液、菌片的制备程序20C± 1C。最短不得小于 30s 。常规作用时间为 中和剂鉴定用试液浓度应为正式杀菌试验最高浓度。 正式 杀菌试验用菌悬液的浓度、取量应与2min、5min、 1 0min、 20min。中和剂鉴定中 1 组、 2 组所用菌悬液的浓菌悬液的制备 取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37C培养型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37C培养18h24h,即为第每隔 2-3 个月移种一次，继续保藏。 ）。取含 取

3、第 3 代 14 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经 稀释液加入斜面试管内37C培养18h24h。用接种环取第118h24h。挑取上述第2代培养物中典3代培养物（放在 4 C左右冰箱中保藏。18h 24h 培养），用吸管吸取，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用 吸管将洗液移至另一无菌 试管 中，在手掌上振敲 80 次（力度适中，勿溅出） 苔，接种在适合试验菌生长的培养基中， 品微生物学检验手册 211 页）37C培养18h，以使细菌悬液均匀。或从新鲜菌种斜面沾取少量菌24h （或适宜时间）。作为原菌液。（源于药细菌繁殖体悬液应保存在4 C冰箱备用尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的自然死亡。应当

4、天使用不得过夜。44回收菌数为 1X 109X 10 cfu/ml 用 PBS液配置GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准回收菌数为1 X 108 5X 108cfu/ml用TSB营养肉汤配置一 2002消毒技术规范、菌片的制备程序 ： 消毒技术规范 取冻干菌种管，在无菌操作下，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吸吹数次，使菌种融化分散。取含营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置代培养的菌悬液，划线于营养琼脂培养基平板上，于37C培养型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37C培养18h24h,即为第37C培养18h24h。用接种环取第 1 18h24h。挑取上述第 2代培养物中典 3 代

5、培养物。 取第3代14代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（经18h24h培养），用吸管吸取TSB营养肉汤 加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用吸管将洗液移至另无菌试管中,在手掌上振敲 80 次,以使细菌悬液均匀,含菌量 用无菌镊子夹住已灭菌10mmT0mm纸一角，一面朝上，注入温箱中干燥 20min-30min ,（或在室温自然阴干后使用）制成菌片。每个菌片回收菌落,按活菌培养计数 得结果，应为5X 105 5X 106 cfu/ 片。）细菌繁殖体悬液和菌片，用毕应随时保存在 自然死亡。（应当天使用不得过夜。 ） 3、操作程序、悬液定量法杀菌试验操作程序 样品用无菌标准硬水稀释至同中和剂

6、鉴定用试液浓度，或低于中和剂鉴定用试液浓度，制成（稀释 试验样液。881X 10 5X 10 cfu/ml 。10ul 菌悬液，放到无菌平板内，4C冰箱内。尽量减少在室温下放置时间，以减少细菌的、液）、将试管按需要数量分别排列于试管架上,各组由左向右,排序、标记。44配制菌悬液,浓度为 1X 10 cfu/ml、9X108 8 X10 5X10 cfu/ml、取杀菌试验用无菌大试管，先加入5min ，用无菌吸管吸取步骤GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准或2002 消毒技术规范试验用菌悬液，再加入有机干扰物质，混匀，置 20± 1C1 中的试验样液 注入其中，或吸取试验

7、用菌悬液 ，加入到含80 次）。 - 见 QB/T 2738-2005手掌上振摇 80 次）。- 见消毒技术规范 开启计时器，并迅速混匀（在手掌上振摇作用2min、5min、10min、20min,即刻用无菌吸管吸取 移入鉴定合格的、37C立即开启计时器， 并迅速混匀（在5ml 样液的试管中，立 即中（中和剂的中和剂溶液10min 后,取样液、 10 倍- 见消毒技术规范 ）（见图四）,置于15ml 作浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀， 系列稀释液 （见 GB15979-200）2 或分别吸取 2个灭菌平皿，用凉至4045C营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵母菌）倾注，转动平皿，

8、 使其充分均匀，琼脂凝固后翻转平板，25C± 2 C培养72h,作活菌菌落计数。中和作用ml35C± 2 C培养48h （细菌）或（酵母菌）、同时用稀释液代替样液进行平行试验，作为阳性对照管。阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。 计数菌落时，个稀释度 3 个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该 合乎上述标准，则以该合格的 2试验重复 3 次，求其平均值。、般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在 15cfu 300cfu 的平板为准，每3 个平板的菌落平均值作为结果；若有 2 个符合 个平板菌落的平均值作为结果。各组活菌浓度换算为对数值（

9、 N）载体法杀菌试验操作程序根据各组活菌浓度（ cfu/ml ），计算杀菌率，见计算公式 1。或根据 ，计算杀灭对数值，见计算公式2。2、即刻混匀，并按规定时间吸取样液进行随后的培养检测；、吸取样液 放入灭菌平皿，另吸取 菌片一角放入试样皿和阳性对照皿。PBS 注入平皿中、作用至设定时间后，即刻用无菌镊子夹住菌片一角，投入含 容量应与鉴定试验结果规定的相同）充分混匀计时。（见图四），置于两个灭菌平皿，接种凉至 40 15ml ，转动平皿 10-20 下，使其充分均匀，凝固中和剂的试管中（中和剂的浓度见图三 ）中和 10min 后，取样液或 10 倍系列稀释液 营养琼脂培养基或沙氏琼脂培养基（酵

10、母菌） 于35C± 2 C培养48h （细菌）或72h （酵母菌），作活菌菌落计数。、试验重复 3次，求其平均值。、阴性对照组：分别吸取试验用相关溶液和培养基进行培养，观察有无污染。、45C后，、试验样品用无菌标准硬水（过滤除菌）稀释至规定浓度，制成（稀释液）试验样液。 作为阳性对照皿。每皿用无菌镊子 夹住A、B、空白平皿，倾注营养琼脂培养基（细菌）或沙氏琼脂培养基（酵母菌）15ml 培养。、计数菌落时，一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以菌落数在15cfu300cfu的平板为准，每 个稀释度 3 个平板生长菌落数全部合乎上述标准，则以该 3 个平板的菌落平均值作为结果；若有 乎上

11、述标准，则以该合格的 2 个平板菌落的平均值作为结果4、计算公式C、15cfu2 个符 合合PBC液（L磷酸盐缓冲液）、无菌标准硬水 1ml 置于灭菌平皿内、1 杀菌率 X1 =( A - B) / AX 100%式中:杀菌率（% ;A- 对照样品平均菌落数；B- 被试样品平均菌落数。2、杀灭对数值（KL ）=对照组平均活菌浓度的对数值（ Nc）-试验组活菌浓度的对数值（ 备注：计算杀灭对数值时，取小数点后两位值，可以进行数字修约。如果消毒试验组消毒处理后平均生产菌落数，小于等于 1 时，即大于等于试验前对照组平均活菌浓度的对数 值。 5 、评价标准杀菌率 90%,产品有杀菌作用。悬液定量杀灭

12、试验中，各次的杀灭对数 值，可判定为消毒合格。1、6、 操作要点：（消毒技术规范 2002 版） 对接触消毒剂（杀菌剂）的样本，在达到规定作用时间，即刻取样移入鉴定合格的中和剂 溶液中（中和剂的浓度与容量应与鉴定试验结果规定的相同）；3、 在将样本接种培养基以前的操作，应按规定时间内进行，以免微生物与中和剂或中和产物 接触过久。审核：编制：引用标准： QB/T2738-2005GB 15979-200210200210一、定义和术语中和剂悬液定量鉴定试验操作程序日化产品抗菌抑菌效果的评价方法（试验菌悬液在一次性使用卫生用品卫生标准（试验菌悬液在1X7 5X1071Xcfu/ml ）消毒技术规范

13、（试验菌悬液在14 9x09 " 104cfU/ml) cfu/ml )中和剂 在微生物杀灭试验中，试验微生物与杀菌剂作用达到规定时间的终点时，用以中和残留的杀菌剂，使其不在持续抑制和杀灭微生物的试剂。中和产物 成。 二、中和剂加杀菌剂 中和剂鉴定试验原理样品）=9 ：1，作用 10min 配置而中和剂鉴定试验原理试验分组试验目的第 1 组第 2 组第 3 组第 4 组第 5 组第 6 组杀菌剂 菌液（杀菌剂 中和剂 菌液（杀菌剂 阳性菌数对照阴性对照。f培养菌 液 ） 中f培养中 和剂） f培养f培养观察杀菌剂对观察残留杀菌观察中和剂是观察中和产阳性对照组。阴性对照组。试验菌有无杀

14、剂被中和后，否抑菌。物，或未被完灭或抑制能力受到杀菌剂作全中和的残留用后的试验菌杀菌剂对试验是否能恢复生菌的生长繁殖长。是否有影响。中和剂鉴定试验中易出现的问题及解决方法解决方法出现的问题、组无菌生长或组平板上少于 菌降低消毒剂浓度或缩短作用时间。本）落，其它组正常。菌落数较多且数量基本相同，其它组正 常。提高消毒剂浓度或延长作用时间。组中和剂菌落数明显少于PBS组菌数降低中和剂浓度或改变中和剂成分。组（中和产物）菌落数明显少于 PBS!菌数， 其它组正常。提高中和剂浓度或改变中和剂成分。多次更换中和剂均不能得到满意结果。选用载体法进行中和剂鉴定，杀菌试验同时用载体法进行。四、鉴定试验操作程序

15、试验分组第 1 组第 2 组第 3 组第 4 组第 5 组第取试验样品 加入各取 中和取中取PBS对应组剂加入对和产物 b（稀释液）加 入对应应组加 入对应组组20C± 1C恒菌悬液菌悬液菌悬液菌悬菌悬液温 硬水 混液 硬水 混匀5min匀振敲 80作用至试验预定时间，作用 10min，次，取 加入下列对应组取加入下列各对应组混匀PBS中和剂中和剂中和产物PBS振敲 80 次、/ 作用 10min/混匀取适宜稀释度悬活菌培养计活菌培养计用中和剂 10用中和产物用稀释液PBS液接种平数数倍系列稀释10 倍系列10各板（ 2 个 / 样稀释倍系列稀释板消毒技术规范6 组中和剂接 种平中和

16、剂悬液定量鉴定试验操作程序中和剂鉴定评价规定中和剂鉴定合 格标准中对 1 、 2 组菌数要求。结论第 1 组不长菌或明显少大于 5 且明于第 2组X( 1-10 )显少于第 3 、4、> (X + 5)>Y第 3、似，误差率w 15%三组间平均菌数=（第3+4+5组菌数）*3 ;误差率 %=（三组平均菌数 - 各组菌落平均数）的绝对值之和/3 X三组间平均菌数X 100Y（ > 10）符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。备注a菌悬液浓度及制备： 消毒技术规范 用PBS（试验菌悬液在 1X 1

17、07 5X 1oCfu/ml ） 混合，作用 10minb 中和产物的配置：先将试验样液与中和剂溶液9ml后制成本）序中和剂鉴定试验操作程序- 载体法试验分组第 1 组第 2 组第 3 组第 4 组第 5 组第 6用无菌镊子取吸取试验吸取试验样品吸取中和剂吸取中和产吸取 PBS组菌片加入下列样品于无菌平于无菌物于于无菌对应组于无菌平皿内平皿内无菌平皿内平皿内皿内四、 2 鉴定试验操作程混匀作用 10min ，立即用无菌镊子取出菌片移入对应组作用至预定时间， 立即用无菌取原液或稀释液 接种本）操作要点PBS中和剂中和剂中和产物稀释液作用 10min作用 10min/用稀释液用稀释液 10用中和剂

18、用中和产物用稀释液 10稀释液+倍1010 倍系列系列稀释倍系列稀释10 倍系列稀倍系列稀释中和剂稀释释各接种平板镊子取出菌片移入对应组试管振打 80次即刻混匀，并按规定时间接种培养基平板（ 2 个 / 样第 1 组不长菌或明第 2 组有且较第1 组为多，较第第 3、4、5 组菌数相似，评价规定显少于第3、 4、 5 组为三组间平均菌数 =（第2少的菌数生十3；组长，并符合下表要求。中和剂鉴定合0>5误差率 %=（三组平均菌数格标准中对 1 、X（1-10 ）>（X 5）数）的绝对值之和 /3 Z2 组菌数要求。丫（ > 10）> 丫X 100中和剂鉴定评价组间平均菌数

19、符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，且其误差率W 15% 第6组无3+4+5 组菌数）各组菌落平均中和剂与试验样品的中结论和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。a菌悬液浓度及制备：用PBS#指示菌制成 1X 1049X备注消毒技术规范用PBS （试验菌悬液在b 中和产物的配置：先将试验样液 与中和剂溶液4104 cfu/ml 悬液。（ -GB15979）1 X 107 5X 107 .,.cfu/ml9ml 混合，作用） 10min 后制成四、 3 鉴定试验操作程序中和剂悬液定量鉴定试验操作程序试验分组第2 组取 菌悬取试验样品加入各液, 分别加入各对应组组振敲 8

20、0次，混匀作用至试验预定时间，取 加入下列对应组PBS中和剂第 3 组第 4 组第 5 组第 6取中和取中取PBS组剂加入对和产物 b 加（稀释液）加应入对应组入对应组组作用 10min，取加入下列各对应组中和剂中和产物PBSGB/T 15979作用 10min振敲 80 次、混取适宜稀释度悬活菌培养计活菌培养计用中和剂 10用中和产物液 接种平板倍系列稀释10 倍系列用稀释液10PB3中和剂各 接种平稀释倍系列稀释第 3、似，第 1 组不长中和剂鉴定评菌或明显少大于 5 且明误差率w 15%价规定于第 2组显少于第 3 、三组间平均菌数4、=（第3+4+5组菌数）* 3 ;差率 %=（三组平均菌数 - 各组菌落平均数）中和剂鉴定合 格标准中对 1 、 2 组菌数要求。结论X( 1-10 )> (X + 5)>Y的绝对值之和/3 X三组间平均菌数X 100Y（ > 10）符合上述评价的中和剂表明可消除试验样品对指示菌的作用，中和剂与试验样品的中和产物对指示菌无毒害，鉴定为该试验样品的中和剂。a菌悬液浓度及制备：用PBS将指示菌制成1X 1049X 104 cfu/ml悬液。（-GB15979）备注b 中和产物的配置：先将试验样液与中和剂溶液9ml