青霉素生产工艺过程

1、青霉素生产工艺过程一、青霉素的发酵工艺过程1、工艺流程（1）丝状菌三级发酵工艺流程 冷冻管（25C，抱子培养，7天）一一斜面母瓶（25C，抱子培养，7天）一一 大米抱子（26C，种子培养56h,1:1.5vvm ）一级种子培养液（27C,种子 培养，24h,1:1.5vvm）二级种子培养液（2726C ,发酵,7 天,1:0.95vvm ） 发酵液。（ 2）球状菌二级发酵工艺流程冷冻管（25 T，抱子培养，68天）一一亲米（25 E，抱子培养，810天）一一 生产米（28C，抱子培养，5660h,1:1.5vvm ） 种子培养液（2625-24°C, 发酵，7天，1: 0.8vvm）

2、发酵液。2、工艺控制（ 1 ）影响发酵产率的因素基质浓度： 在分批发酵中， 常常因为前期基质量浓度过高， 对生物合成酶系 产生阻遏（或抑制）或对菌丝生长产生抑制（如葡萄糖和钱的阻遏或抑制，苯乙 酸的生长抑制） ，而后期基质浓度低限制了菌丝生长和产物合成， 为了避免这一 现象，在青霉素发酵中通常采用补料分批操作法， 即对容易产生阻遏、 抑制和限 制作用的基质进行缓慢流加以维持一定的最适浓度。 这里必须特别注意的是葡萄 糖的流加， 因为即使是超出最适浓度范围较小的波动， 都将引起严重的阻遏或限 制，使生物合成速度减慢或停止。目前 , 糖浓度的检测尚难在线进行 , 故葡萄糖 的流加不是依据糖浓度控制

3、，而是间接根据pH值、溶氧或CQ释放率予以调节。（2）温度： 青霉素发酵的最适温度随所用菌株的不同可能稍有差别，但一般 认为应在25C左右。温度过高将明显降低发酵产率，同时增加葡萄糖的维持消 耗，降低葡萄糖至青霉素的转化率。 对菌丝生长和青霉素合成来说， 最适温度不 是一样的 , 一般前者略高于后者 , 故有的发酵过程在菌丝生长阶段采用较高的 温度，以缩短生长时间 , 到达生产阶段后便适当降低温度， 以利于青霉素的合成。（3）pH值：青霉素发酵的最适pH值一般认为在6.5左右,有时也可以略高或略低一些，但应尽量避免pH值超过7.0,因为青霉素在碱性条件下不稳定,容 易加速其水解。在缓冲能力较弱

4、的培养基中 , pH 值的变化是葡萄糖流加速度高 低的反映。过高的流加速率造成酸性中间产物的积累使pH值降低；过低的加糖速率不足以中和蛋白质代谢产生的氨或其他生理碱性物质代谢产生的碱性化合物而引起pH值上升。（4）溶氧： 对于好氧的青霉素发酵来说，溶氧浓度是影响发酵过程的一个重 要因素。当溶氧浓度降到 30%饱和度以下时 , 青霉素产率急剧下降 , 低于 10%饱 和度时 , 则造成不可逆的损害。溶氧浓度过高，说明菌丝生长不良或加糖率过低， 造成呼吸强度下降 , 同样影响生产能力的发挥。 溶氧浓度是氧传递和氧消耗的一 个动态平衡点 , 而氧消耗与碳能源消耗成正比 , 故溶氧浓度也可作为葡萄糖流

5、 加控制的一个参考指标。（ 5）菌丝浓度： 发酵过程中必须控制菌丝浓度不超过临界菌体浓度 , 从而使氧 传递速率与氧消耗速率在某一溶氧水平上达到平衡。 青霉素发酵的临界菌体浓度 随菌株的呼吸强度 （取决于维持因数的大小 , 维持因数越大 , 呼吸强度越高 ） ，发 酵通气与搅拌能力及发酵的流变学性质而异。 呼吸强度低的菌株降低发酵中氧的 消耗速率，而通气与搅拌能力强的发酵罐及黏度低的发酵液使发酵中的传氧速率 上升 , 从而提高临界菌体浓度。（ 6）菌丝生长速度： 用恒化器进行的发酵试验证明，在葡萄糖限制生长的条件 下，青霉素比生产速率与产生菌菌丝的比生长速率之间呈一定关系。 当比生长速 率低于

6、 0.015h-1 时，比生产速率与比生长速率成正比 , 当比生长速率高于 O.015h-1 时, 比生产速率与比生长速率无关。因此，要在发酵过程中达到并维 持最大比生产速率 , 必须使比生长速率不低 0.015h-1 。这一比生长速率称为临 界比生长速率。对于分批补料发酵的生产阶段来说 , 维持 0.015h-1 的临界比生 长速率意味着每 46h 就要使菌丝浓度或发酵液体积加倍 , 这在实际工业生产中 是很难实现的。 事实上，青霉素工业发酵生产阶段控制的比生长速率要比这一理 论临界值低得多 , 却仍然能达到很高的比生产速率。 这是由于工业上采用的补料 分批发酵过程不断有部分菌丝自溶 , 抵

7、消了一部分生长 , 故虽然表观比生长速 率低 , 但真比生长速率却要高一些。（ 7）菌丝形态： 在长期的菌株改良中，青霉素产生菌在沉没培养中分化为主要 呈丝状生长和结球生长两种形态。 前者由于所有菌丝体都能充分和发酵液中的基 质及氧接触 , 故一般比生产速率较高； 后者则由于发酵液黏度显著降低 , 使气 - 液两相间氧的传递速率大大提高 , 从而允许更多的菌丝生长 （ 即临界菌体浓度 较高 ）, 发酵罐体积产率甚至高于前者。在丝状菌发酵中， 控制菌丝形态使其保持适当的分支和长度 , 并避免结球， 是 获得高产的关键要素之一。而在球状菌发酵中 , 使菌丝球保持适当大小和松紧， 并尽量减少游离菌丝

8、的含量 , 也是充分发挥其生产能力的关键素之一。 这种形态 的控制与糖和氮源的流加状况及速率、搅拌的剪切强度及比生长速率密切相关。3、工艺控制要点（ 1）种子质量的控制 丝状菌的生产种子是由保藏在低温的冷冻安瓿管经甘油、 葡萄糖、蛋白胨斜面移植到小米固体上，25 C培养7天，真空干燥并以这种 形式保存备用。 生产时它按一定的接种量移种到含有葡萄糖、 玉米浆、 尿素为主 的种子罐内,26 C培养56h左右,菌丝浓度达6%-8%,菌丝形态正常,按10%-15%勺接种量移人含有花生饼粉、葡萄糖为主的二级种子罐内 ，27 C培养 24h,菌丝体积10%-12%,形态正常,效价在700D/ml左右便可作

9、为发酵种子。球状菌的生产种子是由冷冻管子孢子经混有 O. 5% -1. 0 % 玉米浆的三角瓶培 养原始亲米孢子 ， 然后再移人罗氏瓶培养生产大米抱子 （ 又称生产米 ）， 亲米和 生产米均为25 C静置培养,需经常观察生长发育情况在培养到 3-4天,大米 表面长出明显小集落时要振摇均匀 ， 使菌丝在大米表面能均匀生长 ， 待 10 天 左右形成绿色孢子即可收获。 亲米成熟接人生产米后也要经过激烈振荡才可放置 恒温培养 ， 生产米的孢子量要求每粒米 300万只以上。 亲米、生产米子孢子都需 保存在5 C冰箱内。工艺要求将新鲜的生产米 （ 指收获后的孢瓶在 10天以内使用） 接人含有花生饼 粉、

10、玉米胚芽粉、葡萄糖、饴糖为主的种子罐内 ，28 C 培养 50-60h 当 pH 值由6. 0-6. 5 下降至5.5-5. 0,菌丝呈菊花团状，平均直径在100- 130卩m,每毫升的球数为 6 万 -8 万只， 沉降率在 85% 以上， 即可根据发酵罐球数控制在 8000-11000只/ml范围的要求，计算移种体积，然后接入发酵罐，多余的种子 液弃去。球状菌以新鲜孢子为佳 , 其生产水平优于真空干燥的孢子， 能使青霉素 发酵单位的罐批差异减少。（2）培养基成分的控制a. 碳源 产黄青霉菌可利用的碳源有乳糖、 蕉糖、葡萄糖等。 目前生产上普遍 采用的是淀粉水解糖、糖化液 （DE 值 50%

11、以上） 进行流加。b. 氮源 氮源常选用玉米浆、精制棉籽饼粉、麸皮，并补加无机氮源（硫酸氨、 氨水或尿素）。c. 前体 生物合成含有苄基基团的青霉素 G， 需在发酵液中加人前体。 前体可用 苯乙酸、苯乙酰胺 ， 一次加入量不大于 0.1%， 并采用多次加入 ， 以防止前体对 青霉素的毒害。d. 无机盐加人的无机盐包括硫、磷、钙、镁、钾等 ， 且用量要适度。另外 ， 由 于铁离子对青霉菌有毒害作用 ， 必须严格控制铁离子的浓度 ， 一般控制在 30卩 g/ml o（3）发酵培养的控制a. 加糖控制 加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 ， 最好是 根据排气中 CO2 量及 O2

12、量来控制， 一般在残糖降至 0.6% 左右， pH 值上升时 开始加糖。b. 补氮及加前体 补氮是指加硫酸铵、氨水或尿素 ， 使发酵液氨氮控制在 O. 01%-0.05%，补前体以使发酵液中残存苯乙酰胺浓度为 0.05%-0.08% 。 -c. pH 值控制 对 pH 值的要求视不同菌种而异 ， 一般为 pH 6.4-6.8， 可以补加葡萄糖来控制。目前一般采用加酸或加碱控制 pH值。d.温度控制 前期2 5- 2 6 C,后期23 C ,以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。e.溶解氧的 控制 一般要求发酵中溶解氧量不低于饱和溶解氧的 30% 。通风比一般为 1 : 0. 8L/(L ? mi

13、n), 搅拌转速在发酵各阶段应根据需要而调整。f. 泡沫的控制 在发酵过程中产生大量泡沫 , 可以用天然油脂 , 如豆油、玉米油 等或用化学合成消泡剂 " 泡敌 " 来消泡 , 应当控制其用量并要少量多次加入 , 尤其在发酵前期不宜多用 , 否则会影响菌体的呼吸代谢g. 发酵液质量控制 生产上按规定时间从发酵罐中取样 , 用显微镜观察菌丝形 态变化来控制发酵。生产上惯称 " 镜检 ", 根据" 镜检 " 中菌丝形变化和代谢变 化的其他指标调节发酵温度 , 通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发酵时 间, 以获得最多青霉素。 当菌丝中空泡扩大、增多及延伸 , 并出现个别自溶