在石蜡切片中进行微切割-PCR-银染的方法

1、在石蜡切片中进行微切割-PCR-银染的方法【摘要】目的探索在石蜡切片中应用微切割-PCR-银染技术，检测大肠癌的微卫星不稳定性和杂合性缺失。方法用微切割技术在28例石蜡切片中提取淋巴细胞和间质细胞、癌旁粘膜腺管、不典型增生腺管、腺瘤腺管和腺癌细胞，每例至少包含3种类型细胞，经蛋白酶K消化后，直接用于PCR扩增，产物进行8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-银染。共进行了TGF-R(A)10、hMSH2(A)26-Bat26，hMSH3(A)8，hMSH6(C)8 4个微卫星位点的检测。结果hMSH3(A)8和hMSH6(C)8位点在28例标本全部扩增出目的片段，而TGF-R(A)10和hMSH2(A)2

2、6位点则分别有23例、22例扩增出目的片段，且hMSH2(A)26位点有5例癌细胞呈阳性，其中1例同时有腺瘤细胞阳性。结论微切割-PCR-银染技术应用于石蜡切片，可获得较满意的结果，可用于检测微卫星不稳定性等研究。【关键词】微切割；聚合酶链反应；银染；石蜡切片；大肠癌；微卫星不稳定性 Methods for microdissection-PCR-silver stain technique in paraffin-embedded tissue sectionsHUANG Zhida, HUANG Qiong, LAI Maode【Abstract】ObjectiveTo use the m

3、icrodissection-PCR-silver stain technique in the paraffin-embedded tissue sections and analyze the microsatellite instability in colorectal cancer. MethodsBy microdissection technique, the lymphocytes and mesenchymal cells, normal mucous epithelial cells, displasia, adenoma, and carcinoma cells were

4、 recovered from paraffin-embedded tissue sections. The cells were digested by protinase K;the cell lysates were used as PCR template and the PCR products were analysed by denatured polyacrylamide gel electrophoresis and silver stain. Four microsatellite loci, TGF- R(A)10, hMSH2(A)26-Bat-26, hMSH3(A)

5、8, hMSH6(C)8,were analyzed. ResultsIn all 28 specimens, hMSH3(A)8 and hMSH6(C)8 loci were amplified successfully.TGF-R(A)10, Bat-26 had consistent amplification in 23/28, 22/28 specimens, respectively. And Bat-26 microsatellite instability was found in carcinoma cells in 5 specimens, and in adenoma

6、cells in one of the 5 specimens. Conclusion Microdissection-PCR-silver stain technique can be used in paraffin-embedded tissue sections with satisfactory results. This method can be employed in analyzing microsatellite instability in colorectal carcinoma. 【Key words】microdissection;polymerase chain

7、reaction;silver stain;paraffin-embedded section;colorectal cancer;microsatellite instability*Project No.39770297, supported by the National Natural Science Foundation of China微切割-PCR技术是在显微镜下精确提取单一类型细胞进行PCR的方法。近年来，微切割-PCR技术在肿瘤发病机理研究中的应用已越来越多。它对判断某基因是否存在杂合性或纯合性缺失、以及基因突变发生于肿瘤进程中的特定阶段等，都有重要的应用价值。国外已报道多种

8、微切割-PCR技术，主要应用于冰冻切片中，现已成功地在石蜡切片中得以应用。邓飞等1在淋巴瘤冰冻切片中提取单个细胞进行PCR，扩增成功率为31.6%，而在石蜡切片中提取细胞数多至37个仍未能扩增出特异性产物。国内尚未见在大肠癌的石蜡切片中进行微切割-PCR的报道。我们在大肠癌的石蜡切片中进行了微切割-PCR-银染技术的探索，以便用于检测微卫星不稳定性等的研究。1材料和方法1.1材料表14对引物序列及PCR产物Table 1Primer sequences and PCR productsLocus(位点)Primer sequence(引物序列)Product(产物)Bat-265-TGACTA

9、CTTTTGACTTCAGCC-3121 bp含(A)265-AACCATTCAACATTTTTAACCC-3TGF-R5-AAGCTCCCCTACCATGACT-3118 bp含(A)105-TGCACTCATCAGAGCTACAG-3hMSH35-AGATGTGAATCCCCTAATCAAGC-3153 bp含(A)85-ACTCCCACAATGCCAATAAAAAT-3hMSH65-GGGTGATGGTCCTATGTGTC-394 bp含(C)85-CGTAATGCAAGGATGGCGT-31.2方法1.2.1石蜡切片预处理脱蜡、水化、染色：10 m石蜡切片经二甲苯脱蜡两次，各15 mi

10、n；100%、95%、75%、50%乙醇水化各5 min；蒸馏水5 min，两次；0.08%甲苯胺蓝染色30 s。洗涤后置蒸馏水中待用2。1.2.2微切割用玻璃微电极在酒精灯下自制成微切割工具。在切片上滴加少许灭菌双蒸水，Olympus光学显微镜，10倍物镜下进行微切割。可分别提取淋巴细胞、间质细胞、癌旁粘膜腺管、腺瘤腺管、不典型增生腺管及癌细胞，每例至少包含3种类型细胞(1，2)。 1肿瘤组织微切割前Fig 1Tumor tissue section before microdissection2肿瘤组织微切割后Fig 2Tumor tissue section after microdis

11、section1.2.3提取细胞的消化提取的细胞约30004000个置50 l消化液(TET：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，2 mmol/L EDTA pH8.0，0.5%Tween-20，0.5 mg/ml蛋白酶K)，55 3 h，95 10 min灭活蛋白酶K。此细胞消化液即可用作PCR扩增模板。1.2.4PCR体系、参数总体积为25 l，含10缓冲液(Promega)2.5 l，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.5 l(终浓度200 mol/L)，MgCl2 1.8 l(25 mmol/L，终浓度为1.8 mmol/L)，引物各0.3 l(终浓度150 nm

12、ol/L)，Taq酶(Promega)0.1 l(0.5 U)，模板2 l；95 4 min，95 30 s，53 30 s，72 30 s 45(或50)个循环，72 5 min(Eppendorf梯度PCR仪)。1.2.5对照TET消化液作空白对照，新鲜大肠癌组织抽提DNA作阳性对照。1.3结果观察1.3.1电泳8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(7 mol/L尿素)：800V 1.5 h 7.5 l PCR产物+7.5 l变性缓冲液(98%甲酰胺，2% EDTA 0.5 mol/L pH8.0，0.025%溴酚蓝)95 5 min，冰水骤冷，上样。1.3.2银染3试剂：10%乙醇、1%硝酸、0.

13、012 mol/L硝酸银、0.28 mol/L碳酸钠(含0.65甲醛)、10%乙酸；步骤：10%乙醇5 min，蒸馏水漂洗1 min；1%硝酸3 min，蒸馏水漂洗1 min；0.012 mol/L AgNO3 10 min，蒸馏水漂洗2030 s；0.28 mol/L Na2CO3(含甲醛)约56 min；10%乙酸3 min，蒸馏水洗涤。制成干胶。2结果hMSH3、hMSH6位点所有病例均见特异产物条带(3)。3hMSH3(A)8位点PCR产物电泳1：淋巴细胞，间质细胞；2：癌旁正常粘膜腺管；3：癌细胞；4：阳性对照；5：空白管Fig 3Electrophoresis band of lo

14、cus hMSH3(A)8 PCR productsLane 1：lymphocytes,mesenchymal cells;lane 2：normal appearance glands adjacent to cancer; lane 3:cancerous cells; 4:positive control; lane 5:blankTGR-R位点23例见特异产物条带，5例扩增效果不佳，扩增不稳定，其中1996年3例(3/10)、1998年2例(2/18)。Bat-26位点22例见特异条带，6例扩增效果不佳，扩增不稳定，其中1996年4例(4/10)，1998年2例(2/18)。其中5例

15、在癌细胞中有电泳条带的改变，有1例同时在腺瘤细胞中有电泳条带改变(4)。4Bat-26位点PCR产物电泳1：淋巴细胞，间质细胞；2：癌旁正常粘膜腺管；3：腺瘤细胞；4：癌细胞；5：空白管Fig 4Electrophoresis bands of locus Bat-26Lane 1:lymphocytes, mesenchymal cells;lane 2:normal appearance glands adjacent to cancer;lane 3: adenoma cells; lane 4: cancerous cells; lane 5:blank3讨论国外微切割-PCR技术主要

16、应用于冰冻切片，现已成功地在石蜡切片中得以应用，近年已广泛应用于各种实体瘤的研究，微切割技术也从简单的机械操作发展成以先进的激光捕获技术为主。由于石蜡切片制作过程中可造成DNA损伤等因素，导致石蜡切片微切割-PCR有一定难度，国内尚未见在石蜡切片中进行微切割-PCR较成功的报道。在实验中我们有以下几点体会。3.1微切割细胞数量50 l消化液中经微切割提取的细胞数量最好在30004000以上。这样，每个PCR反应管可含120160以上细胞的DNA量，PCR扩增效果较好。邓飞等在淋巴瘤石蜡切片中提取537个细胞/PCR反应管，均不能扩增出特异性产物。说明石蜡切片中提取细胞进行PCR，必须有足够的细胞量。3.2PCR扩增有两点值得注意：(1)要有合适的引物浓度：引物浓度不能太高，否则极易形成引物二聚体，严重影响模板的扩增效率；太低亦影响扩增效率。(2)理想的循环数；4550个PCR循环扩增效率较好，少至35个循环极易出现扩增效率不均一。3.3银染银染是较好的观察结果方法，其灵敏度比EB染色高。银染对环境温度较为敏感，应根据不同环境温度调整AgNO3、Na2CO3的作用时间。在冬天，AgNO3可作用15 min，Na2CO3作用时间可延长1倍至12 min左右。如不延长Na2CO3作用时间则易导致银染失败的结论。3.4微切割在普通光学显微镜下进行是可行的，不必购置贵重的仪器，但对操作者