何水林版基因工程第四章基因工程的主要技术与原理ppt课件

1、第四章 基因工程的主要技术与原理周毅峰2019.03 核酸的提取与纯化核酸的提取与纯化 核酸电泳核酸电泳 分子杂交分子杂交 PCR技术技术 DNA序列分析序列分析 大分子相互作用大分子相互作用 1、核酸的提取与纯化、核酸的提取与纯化破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放资料预备资料预备核酸分别、纯化核酸分别、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中2060bp 1.1、基因组、基因组DNA的提取与纯化的提取与纯化DNA溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂DNA钠盐比游离态更易溶于水钠盐

2、比游离态更易溶于水DNP在在0.14mol/LNaCl中的溶解度是水中的中的溶解度是水中的1%DNP在在1mol/LNaCl中的溶解度是水中的中的溶解度是水中的2倍倍生物资料的预备生物资料的预备新颖，或者冻存的样品液氮中研磨加缓冲液EDTA螯合Mg2+、Ca2+SDS变性蛋白质-巯基乙醇、DTT翻开二硫键和抗氧化PVP与酚和多糖结合及抗氧化裂解细胞裂解细胞除杂除杂加CTAB或SDS结合多糖和蛋白加酚仿去蛋白纯化与保管纯化与保管加乙醇或异丙醇沉淀加乙醇反洗涤吹干水或TE溶解20保管基因组基因组DNA的提取的提取 - 酚抽提法酚抽提法样品的预备细胞的裂解蛋白量变性DNA的抽提DNA的沉淀血基因组血

3、基因组DNA试剂盒试剂盒酵母基因组酵母基因组DNA试剂盒试剂盒细菌基因组细菌基因组DNA试剂盒试剂盒细胞基因组细胞基因组DNA试剂盒试剂盒qCTABCTAB法流程图法流程图植物资料植物资料裂解液裂解液上层溶液上层溶液液氮研磨液氮研磨抽提抽提细胞裂解细胞裂解枯燥溶解枯燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液q SDS SDS法流程图法流程图 以动物组以动物组织为例织为例 动物组织动物组织细胞裂解细胞裂解上层溶液上层溶液组织匀浆组织匀浆抽提抽提枯燥溶解枯燥溶解离心洗涤离心洗涤酒精沉淀酒精沉淀DNA溶液溶液利用利用RNP和和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分别在盐溶液中溶解度不同，将二

4、者分别有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分别各种内容物利用不同内容物密度不同的原理分别各种内容物浓盐法：浓盐法：有机溶剂抽提法：有机溶剂抽提法：密度梯度离心法：密度梯度离心法：q 蛋白质的去除：蛋白质的去除：q 酚酚/ /氯仿抽提氯仿抽提q 运用变性剂变性运用变性剂变性SDSSDS、异硫、异硫氰酸胍等氰酸胍等q 高盐洗涤高盐洗涤q 蛋白酶处置蛋白酶处置q多糖的去除：多糖的去除：q高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参与高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参与1/2体积的体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖

5、。，高盐可溶解多糖。q用多糖水解酶将多糖降解。用多糖水解酶将多糖降解。q在提取缓冲液中加一定量的氯苯在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积体积)，氯苯可以与多糖的，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖羟基作用，从而去除多糖 。q用用PEG8000替代乙醇沉淀替代乙醇沉淀DNA：在：在500L DNA液中参与液中参与200l 20% PEG8000 (含含1.2 M NaCl) ，冰浴，冰浴20min。q 多酚的去除：多酚的去除：q 在抽提液中参与防止酚类氧化的试剂：在抽提液中参与防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等硫苏糖醇等q 参

6、与易与酚类结合的试剂：如参与易与酚类结合的试剂：如PVPPVP、PEG(PEG(聚乙二醇聚乙二醇) )，它们与酚类有较强的亲和力，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与，可防止酚类与DNADNA的结合的结合q 盐离子的去除：盐离子的去除：q 7070的乙醇洗涤的乙醇洗涤 CTAB溶液配制好备用，65水浴预热。猕猴桃叶片或果实采取后最好立刻放到液氮中,防止酚类物质氧化 65水浴一个小时 氯仿：乙醇：异戊醇=80:16:4的抽提液 两次。10000转/分别心20分钟，尽量把丝状物压紧，防止汲取上清时有丝状物牵拉 等体积预冷的异丙醇 ，75%乙醇洗去其他杂质。洗两次 。 用无水乙醇5毫升洗一次。晾干

7、5分钟挥发掉乙醇后参与3-5mlTE溶解，参与5ul,1mg/ml的RNA酶后保管 猕猴桃DNA提取实例qCTAB提取缓冲液的改良配方提取缓冲液的改良配方猕猴桃基因组猕猴桃基因组DNA闭合环状的质粒闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分别，复性快；，在变性后不会分别，复性快；原理1.2、碱裂解法提取质粒DNADNA双链双链变性变性DNA单链单链复性复性强碱强碱中性中性染色体线性染色体线性DNA和或有缺口的质粒和或有缺口的质粒DNA变性后双链分别，难以复性变性后双链分别，难以复性而构成缠绕的构造，与蛋白质而构成缠绕的构造，与蛋白质SDS复合物结合在一同；当复合物结合在一同；当K+取代取代Na+时时

8、,生成不溶的生成不溶的PDS， 这些复合物从溶液中沉淀下来。这些复合物从溶液中沉淀下来。变性变性利用宿主菌线状染色体利用宿主菌线状染色体DNA与闭环双链质粒与闭环双链质粒DNA的构造的构造形状的差别来提取质粒形状的差别来提取质粒DNA。当同时碱变性时，线状基因组当同时碱变性时，线状基因组DNA变性充分而质粒变性充分而质粒DNA处于拓扑缠绕的自然形状而不能彼此分开。处于拓扑缠绕的自然形状而不能彼此分开。 当条件恢复时酸中和，质粒当条件恢复时酸中和，质粒DNA迅速准确配置重新迅速准确配置重新构成完全天然超螺旋分子，而线状构成完全天然超螺旋分子，而线状DNA那么与破裂的细那么与破裂的细胞壁，细菌蛋白

9、相互缠绕成大型复合物，被胞壁，细菌蛋白相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖。包盖。当当K+取代取代Na+时时,这些复合物会从溶液中沉淀下来，附这些复合物会从溶液中沉淀下来，附在细胞碎片上一同被离心除去。在细胞碎片上一同被离心除去。 碱裂解法碱裂解法所用的试剂作用所用的试剂作用 葡萄糖葡萄糖添加溶液的粘度，维持浸透压，防止添加溶液的粘度，维持浸透压，防止DNA受机械力震荡的作用而受机械力震荡的作用而降解。降解。 EDTAMg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止酶的活性，防止DNA被酶降解。被酶降解。 NaOH-SDSNaOH：强碱，提供：强碱，提供pH12的碱性条件

10、，使的碱性条件，使DNA双链变性。双链变性。SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白蛋白SDS复合复合物，使蛋白质包括物，使蛋白质包括DNA酶变性沉淀。酶变性沉淀。冰醋酸把醋酸钾溶液的冰醋酸把醋酸钾溶液的pH调到调到4.8。用来中和用来中和NaOH变性液，使变性液，使DNA复性。复性。高浓度的高浓度的K+置换置换Na+，生成不溶的，生成不溶的PDS用于沉淀用于沉淀DNA。 乙醇乙醇DNA分子以水合形状分子以水合形状“溶于溶于水里，乙醇能夺去水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。分子的水环境。 KAc-HAc缓冲液缓冲液 RNase A降解降解RNA

11、渣滓。渣滓。以免提取后的以免提取后的DNA中含有小分子的中含有小分子的RNA。 TE缓冲液缓冲液DNA保管液。保管液。由由Tris-HCl和和EDTA配制。配制。 Tris-HCl维持溶液中维持溶液中pH值相对稳定；值相对稳定；EDTA抑制抑制DNA酶，防止酶，防止DNA被酶降解。被酶降解。蛋白变性剂，进一步抽提蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。但苯酚会残留在但苯酚会残留在DNA溶液中。溶液中。现多用各种商品化的层析柱纯化现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。 酚酚-氯仿氯仿选用选用以上试剂有商业试剂盒；也可以本人配制。以上试剂有商业试剂盒

12、；也可以本人配制。碱抽提法提取质粒碱抽提法提取质粒DNA的步骤的步骤 Solution I 的配制：的配制：运用运用“溶液溶液悬浮菌体。悬浮菌体。第一步：悬浮菌体第一步：悬浮菌体25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA溶液溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。变性。第二步：破膜，蛋白质和第二步：破膜，蛋白质和DNA变性变性Solution II 的配制：的配制：0.2N NaOH，1.0%SDS第三步：中和第三步：中和溶液溶液III使使DNA复性、并促使蛋白质复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体复合物和染色体DNA沉淀。沉淀。Solution I

13、II的配制：的配制：5M 乙酸钾用冰醋酸调乙酸钾用冰醋酸调pH至至4.8上清液中含有闭合质粒上清液中含有闭合质粒DNA。第四步：离心除去沉淀第四步：离心除去沉淀0.6倍体积的异丙醇或倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。倍体积的乙醇。第五步：纯化第五步：纯化DNA上清液过柱或酚上清液过柱或酚-氯仿抽提。氯仿抽提。第六步：沉淀第六步：沉淀DNA最好运用新颖资料，低温保管的最好运用新颖资料，低温保管的样品资料不要反复冻融样品资料不要反复冻融提取血液基因组提取血液基因组DNA时，要选时，要选择有核细胞白细胞择有核细胞白细胞组培细胞培育时间不能过长，否组培细胞培育时间不能过长，否那么会呵斥那么会呵斥DNA降

14、解降解含病毒的液体资料含病毒的液体资料DNA含量较含量较少，提取前先富集少，提取前先富集基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取运用途于对数期的新颖菌体老运用途于对数期的新颖菌体老化菌体导致开环质粒添加化菌体导致开环质粒添加培育时应参与挑选压力，否那么培育时应参与挑选压力，否那么菌体易污染，质粒易丧失菌体易污染，质粒易丧失尽量选择高拷贝的质粒，如为低尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，那么应加大菌体拷贝或大质粒，那么应加大菌体用量用量菌株不要频繁转接质粒丧失菌株不要频繁转接质粒丧失资料应适量，过多会影响裂解，资料应适量，过多会影响裂解，导致导致DNA量少，纯度

15、低量少，纯度低针对不同资料，选择适当的裂针对不同资料，选择适当的裂解预处置方式：解预处置方式：植物资料液氮研磨植物资料液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组培细胞蛋白酶组培细胞蛋白酶K细菌溶菌酶破壁细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡高温温浴时，定时轻柔振荡基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取菌体量适当菌体量适当培育基去除干净，同时保证菌培育基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长变性的时间不要过长5分钟，分钟，否那么质粒易被打断否那么质粒易被打断复性时间也不宜过长，否

16、那么复性时间也不宜过长，否那么会有基因组会有基因组DNA的污染的污染G菌、酵母质粒的提取，应先菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处置，以破壁用酶法或机械法处置，以破壁采用吸附资料吸附的方式分别采用吸附资料吸附的方式分别DNA时，应提供相时，应提供相应的缓冲体系应的缓冲体系采用有机酚采用有机酚/氯仿抽提时应充分混匀，但动作氯仿抽提时应充分混匀，但动作要轻柔要轻柔离心分别两相时，应保证一定的转速和时间猕离心分别两相时，应保证一定的转速和时间猕猴桃大提，猴桃大提，10000转转20min针对不同资料的特点，在提取过程中辅以相应的针对不同资料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法去杂质的方法基

17、因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分淀会更充分沉淀时参与沉淀时参与1/10体积的体积的NaAcpH5.2，3M，有利于，有利于充分沉淀充分沉淀沉淀后运用沉淀后运用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干晾干DNA，让乙醇充分挥发不要过分枯燥，让乙醇充分挥发不要过分枯燥假设长期储存建议运用假设长期储存建议运用TE缓冲液溶解缓冲液溶解TE中的中的EDTA能螯和能螯和Mg2+或或Mn2+离子，抑制离子，抑制DNasepH值为值为8.0，可防止，可防止

18、DNA发生酸解发生酸解 基因组基因组DNADNA的提取的提取质粒质粒DNADNA的提取的提取DNADNA中含有蛋白、多中含有蛋白、多糖、多酚类杂质糖、多酚类杂质DNADNA在溶解前，有酒在溶解前，有酒精残留，酒精抑制精残留，酒精抑制后续酶解反响后续酶解反响DNADNA中残留有金属离中残留有金属离子子重新纯化重新纯化DNADNA，去除蛋，去除蛋白、多糖、多酚等杂白、多糖、多酚等杂质详细方法见前质详细方法见前重新沉淀重新沉淀DNADNA，让酒精，让酒精充分挥发充分挥发添加添加7070乙醇洗涤的乙醇洗涤的次数次数2-32-3次次q问题一：问题一：DNADNA样品不纯，抑制后续酶解和样品不纯，抑制后续

19、酶解和PCRPCR反反响。响。 缘由缘由对对策策资料不新颖或反复冻资料不新颖或反复冻融融未很好抑制内源核酸未很好抑制内源核酸酶的活性酶的活性提取过程操作过于猛提取过程操作过于猛烈，烈，DNADNA被机械打断被机械打断外源核酸酶污染外源核酸酶污染反复冻融反复冻融尽量取新颖资料，低温保管资料防尽量取新颖资料，低温保管资料防止反复冻融止反复冻融液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前参与裂解缓冲液前参与裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的资料在提取内源核酸酶含量丰富的资料的的DNADNA时，可添加裂解液中螯合剂时，可添加裂解液中螯合剂的含量的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔细

20、胞裂解后的后续操作应尽量轻柔一切试剂用无菌水配制，耗材经高一切试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌温灭菌将将DNADNA分装保管于缓冲液中，防止分装保管于缓冲液中，防止反复冻融反复冻融q问题二：问题二：DNADNA降解。降解。对对策策 缘由缘由实验资料不佳或量少实验资料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗涤时洗涤时DNADNA丧失丧失尽量选用新颖幼嫩的资尽量选用新颖幼嫩的资料料动植物要匀浆研磨充分；动植物要匀浆研磨充分；G G菌、酵母裂解前先用生物菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延伸高温裂解时，时间适当延伸对于动物细胞、细菌可添

21、对于动物细胞、细菌可添加加PKPK的用量的用量低温沉淀，延伸沉淀时间低温沉淀，延伸沉淀时间加辅助物，促进沉淀加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒液吸出，勿倾倒q问题三：问题三：DNADNA提取量少。提取量少。对对策策 缘由缘由1.2、RNA的提取与纯化的提取与纯化细胞RNA的含量每个细胞的每个细胞的RNA量约为量约为10-5 g 80%-85% rRNA 10%-15% tRNA 1%-5% mRNA 其他其他RNA：hnRNA、 snRNA 、snoRNA液氮中研磨液氮中研磨加蛋白变性剂加蛋白变性剂去除去除DNA和蛋白和蛋白提供超低温抵抗酶活性提供

22、超低温抵抗酶活性异硫氰酸胍、异硫氰酸胍、N-十二烷基肌氨酸钠使蛋白和核酸分别十二烷基肌氨酸钠使蛋白和核酸分别异硫氰酸胍、异硫氰酸胍、-巯基乙醇抑制巯基乙醇抑制RNase活性活性LiCl2沉淀沉淀RNA酚仿或水饱和酚抽提酚仿或水饱和酚抽提DNA和蛋白，将和蛋白，将RNA留水相中留水相中乙醇洗涤杂质，乙醇或异丙醇沉淀乙醇洗涤杂质，乙醇或异丙醇沉淀RNA纯化和沉淀纯化和沉淀RNAq异硫氰酸胍异硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理： 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；上的蛋白变性，核酸释放； 释放出来的释放出来

23、的DNADNA和和RNARNA由于在特定由于在特定pHpH下溶解度的不同而下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分别；分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分别； 有机溶剂抽提，沉淀，得到纯真有机溶剂抽提，沉淀，得到纯真RNARNA。 步骤步骤: : 资料预备：尽量新颖。资料预备：尽量新颖。 器具预备：器具预备：0.1%DEPC0.1%DEPC处置处置2424小时，灭菌；小时，灭菌； 裂解变性：异硫氰酸胍亚硫氢胍，巯基乙醇，裂解变性：异硫氰酸胍亚硫氢胍，巯基乙醇，N-N-月桂肌氨月桂肌氨酸等。酸等。 使细胞及核蛋白复合物变性，释放使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNARN

24、A，有效抑，有效抑制核酸酶。制核酸酶。 纯化分别：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚纯化分别：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除杂氯仿可抽提去除杂物。物。 洗涤：洗涤：7070乙醇。乙醇。 沉淀：异丙醇、无水乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。 乙酸钠乙酸钠pH4.0pH4.0：维持变性的细胞裂解液的：维持变性的细胞裂解液的pHpH值值，沉淀，沉淀RNARNA。 此外还常用氯化锂选择沉淀此外还常用氯化锂选择沉淀RNARNA。q 资料：资料：q 新颖，切忌运用反复冻融的资料新颖，切忌运用反复冻融的资料q 如假设资料来源困难，且实验需求一定的如假设资料来源困难，且实验需求一定的时间间隔。可以先将资料储存

25、在时间间隔。可以先将资料储存在TRIzolTRIzol或或样品储存液中，于样品储存液中，于7070或或2020保管保管q 如要多次提取，请分成多份保管如要多次提取，请分成多份保管q 液氮长期保管，液氮长期保管，7070短期保管短期保管q 样品破碎及裂解：样品破碎及裂解：q 根据不同资料选择不同的处置方法：根据不同资料选择不同的处置方法：q 培育细胞：通常可直接加裂解液裂解培育细胞：通常可直接加裂解液裂解q 酵母和细菌：普通酵母和细菌：普通TRIzolTRIzol可直接裂解，对可直接裂解，对于一些特殊的资料可先用酶或者机械方法于一些特殊的资料可先用酶或者机械方法破壁破壁q 动植物组织：先液氮研磨

26、和匀浆，后加裂动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品坚持冷冻解液裂解。期间动作快速，样品坚持冷冻q 样品量适当，保证充分裂解样品量适当，保证充分裂解q 为减少为减少DNADNA污染，可适当加大裂解液的污染，可适当加大裂解液的用量用量q 纯化：纯化：q 在运用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀在运用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；，且动作快速；q 经典的纯化方法，如经典的纯化方法，如 LiCl LiCl 沉淀等，虽然沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易呵斥经济，但操作时间长，易呵斥 RNA RNA 降解降解；q 柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效柱离心式纯化方法

27、：抽提速度快，能有效去除影响去除影响 RNA RNA 后续酶反响的杂质，是目后续酶反响的杂质，是目前较为理想的选择。前较为理想的选择。1.3 核酸的纯度与浓度鉴定核酸的纯度与浓度鉴定紫外分光光度法紫外分光光度法核酸分子中的碱基具有共轭双键构造因此可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱可经过A260与A280 的比值来断定有无蛋白质的污染，比值升高与降低均提示不纯 判别核酸样品的纯度DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0纯纯DNA 比值比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染、苯酚污染纯纯R

28、NA 比值比值2.0， Hairpin and Cross DimerDimer得到产物的机率，应大于50%PCR反响条件的选择反响条件的选择 温度与时间的设置温度与时间的设置 三温度点法三温度点法 双链双链DNA在在9095变性，再迅速冷却至变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至后快速升温至7075，在，在Taq DNA 聚合酶聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸的作用下，使引物链沿模板延伸 (规范反响规范反响) 二温度点法二温度点法 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，普除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，普通采用通采用9

29、4变性，变性，65左右退火与延伸左右退火与延伸(此温度此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性酶仍有较高的催化活性)。 较短靶基因较短靶基因(长度为长度为100300bp)时时变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要缘由。普失败的最主要缘由。普通情况下，通情况下，9394 1min足以使模板足以使模板DNA变性，假设低变性，假设低于于93那么那么 需延伸时间，但温度不能过高，由于高温环境对需延伸时间，但温度不能过高，由于高温环境对酶的活性有影响。此步假设不能使靶基因模板或酶的活性有影响。此步假设不能使靶基因模板或PCR产物完产物完全变性，就会导致全变性，就会导

30、致PCR失败。失败。 变性温度与时间变性温度与时间退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要要素。变性特异性的较重要要素。变性后温度快速冷却至后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发，可使引物和模板发生结合。由于模板生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合时机远远高于模板互补链之间模板之间的碰撞结合时机远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于度。对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的

31、引物，的引物，55为选择为选择最适退火温度的起点较为理想。最适退火温度的起点较为理想。 退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：引物的复性温度可经过以下公式协助选择适宜的温度：引物的复性温度可经过以下公式协助选择适宜的温度：Tm值值(解链温度解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度复性温度=Tm值值-(510)在在Tm值允许范围内，值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高和模板间的非特异性结合，提高PCR反响的特异性。复性时间普反响的特异性。复性时间普通为通为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。，足以使引物与

32、模板之间完全结合。 Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性：7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子高于高于90时，时， DNA合成几乎不能进展。合成几乎不能进展。延伸温度与时间：延伸温度与时间： PCR反响的延伸温度普通选择在反响的延伸温度普通选择在7075之间，常用温度为之间，常用温度为72，过高，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反响的时间，可根据待扩增延伸反响的时间，可根据待扩增片段的长度而定，普通片段的长度而定，普通1Kb以内的以内的DN

33、A片段，延伸时间片段，延伸时间1min是足够是足够 的。的。34kb的靶序列需的靶序列需34min；扩增；扩增10Kb需延伸至需延伸至15min。延伸进间过长会导致。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数决议循环次数决议PCR扩增程度。扩增程度。PCR循环次数主要取循环次数主要取决于模板决于模板DNA的浓度。普通的循环次数选在的浓度。普通的循环次数选在3040次之次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。 循环次数循环次数PCR实验

34、操作过程实验操作过程PCR产物纯产物纯化化PCR产物纯化试剂盒产物纯化试剂盒PCR产物电产物电泳泳正对照有条带，而样品那么无正对照有条带，而样品那么无缘由：缘由：该该Buffer对样品不适宜对样品不适宜引物设计不当或者发生降解引物设计不当或者发生降解模板模板:含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低反响条件：退火温度太高，延伸时间太短反响条件：退火温度太高，延伸时间太短优化优化纯化模板或者运用试剂盒提取模板纯化模板或者运用试剂盒提取模板DNA改换改换Buffer或调整浓度或调整浓度重新设计引物防止链间二聚体和链内二级构重新设计引物防止链间二聚体和链内二级构造造或者换一管新引物或者换一管新引物降低退

35、火温度、延伸延伸时间降低退火温度、延伸延伸时间非特异性扩增非特异性扩增景象：PCR扩增后出现的条带与估计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带缘由：引物特异性差酶纯度不高Mg2+浓度偏高退火温度偏低Buffer不适宜循环次数过多处理：重新设计引物或者运用巢式PCR换用高纯度的酶降低镁离子浓度适当提高退火温度或运用二阶段温度法改换Buffer减少循环次数 拖尾拖尾景象：产物在凝胶上呈景象：产物在凝胶上呈Smear形状形状缘由：缘由：酶量过多酶量过多模板不纯模板不纯循环次数过多循环次数过多dNTP、Mg2+浓度偏高浓度偏高退火温度偏低退火温度偏低Buffer不适宜不适宜处

36、理：处理：适量用酶适量用酶纯化模板纯化模板减少循环次数减少循环次数适当降低适当降低dNTP和镁离子的浓和镁离子的浓度度适当提高退火温度适当提高退火温度改换改换Buffer假阳性假阳性景象：空白对照出现目的扩增产物缘由：靶序列或扩增产物的交叉污染对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外除酶及不能耐高温的物质外，一切试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性运用。各种试剂最好先进展分装，然后低温储存。 双脱氧法测序双脱氧法测序 (Sanger dideoxy procedure )5DNA序列的测定序列的测定(Sanger dideoxy procedure )

37、大规模测序的战略和测序技术的大规模测序的战略和测序技术的开展开展化学法测序化学法测序(Maxam-Gilbert procedure) Frederick SangerDNA的合成过程中，在合成的的合成过程中，在合成的DNA链的链的3末端，根据碱基配对的原那么，末端，根据碱基配对的原那么，经过生成新的经过生成新的3，5-磷酸二酯键，使磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的链合成终止，产生短的DNA链。链。产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。链。5.1双脱氧法测序双脱氧法测序 (Sanger dideoxy procedure )双脱氧法测

38、序双脱氧法测序 原理原理双双脱脱氧氧法法测测序序根根本本过过程程自动测序电泳安装自动测序电泳安装An example of a portion of a chromatogram from automated sequencing Automated sequencing is based on the dideoxy methodology, but four different fluorescent dye-labelled ddNTPs are used. Thus each fluorescent label can be detected by its characteristic

39、 spectrum. The products are separated by automated electrophoresis and the bands detected by fluorescence spectroscopy. Sanger测序仪采用测序仪采用96个毛细电泳管的个毛细电泳管的阵列，可以同时进展阵列，可以同时进展96个这样的测序反响，个这样的测序反响，每个反响得到的每个反响得到的Read长度可以到达长度可以到达1000bp以上以上 MEGABACE1000 DNA测序仪 多多道道移移液液器器96孔反响板孔反响板双脱氧法测序双脱氧法测序 程序程序将待测基因序列打断成较将

40、待测基因序列打断成较短重叠的短重叠的DNA片段群片段群DNA片段连入载体，在片段连入载体，在E.coli体内扩增，挑取单菌落，分别体内扩增，挑取单菌落，分别纯化重组载体测序纯化重组载体测序参与参与DNA聚合酶，聚合酶，dNTP以及带有荧以及带有荧光标志的双脱氧核光标志的双脱氧核苷酸苷酸ddNTP凝胶电泳，检测标志过的核凝胶电泳，检测标志过的核苷酸片段的荧光信号。根据苷酸片段的荧光信号。根据重叠序列，经过软件处置，重叠序列，经过软件处置，DNA序列信息序列信息测序载体测序载体pUC：双链质粒载体，衍生的载体很多，不同商业公司有所：双链质粒载体，衍生的载体很多，不同商业公司有所不同，但根本均由不同

41、，但根本均由pUC衍生而来，运用时需先变性衍生而来，运用时需先变性M13系列和系列和pUC系列的测序载体的运用防止了运用物理方法系列的测序载体的运用防止了运用物理方法分别大量的分别大量的DNAM13：单链噬菌体载体，目前很少采用：单链噬菌体载体，目前很少采用测序测序DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段53的聚合酶活性，的聚合酶活性，35的外切酶活性的外切酶活性继续合成才干不强，不能复制富含二级构造的模板区继续合成才干不强，不能复制富含二级构造的模板区以以ddNTP为底物的才干远比在为底物的才干远比在dNTP低低易受易受DNA制备时经常产生的污染物的影响，且只对单链模板有效制

42、备时经常产生的污染物的影响，且只对单链模板有效T7噬菌体聚合酶噬菌体聚合酶(测序酶测序酶)是一种经过修饰的是一种经过修饰的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶，缺乏聚合酶，缺乏35外切酶活性外切酶活性能产生出非常美丽的能产生出非常美丽的DNA梯带，每条带都具有类似的强度，可读的梯带，每条带都具有类似的强度，可读的DNA序列可覆盖凝胶的全长序列可覆盖凝胶的全长测序酶催化测序酶催化ddNTP结合的速率是结合的速率是dNTP的的33%具有具有1.0和和2.0两个版本，两个版本，2.0取代了取代了1.0，能对折叠成二级构造的模板起，能对折叠成二级构造的模板起作用作用测序酶测序酶526位氨基酸为位氨基酸为Tyr

43、，假设换成，假设换成Phe，结合，结合ddNTP的才干下的才干下降降2000倍，将倍，将E.coliDNAPol或或TaqdnaPol类似氨基酸换面类似氨基酸换面Tyr其其结合结合ddNTP的才干提高的才干提高8000倍倍TaqDNA聚合酶聚合酶它在高温下它在高温下70进展终止链反响的才干可减少测序反响中由于模板进展终止链反响的才干可减少测序反响中由于模板DNA上引物假结合位点与引物退火错配产生的相关问题上引物假结合位点与引物退火错配产生的相关问题在测序凝胶的放射自显影片上条带间的强度不同，从顶部究竟部条带在测序凝胶的放射自显影片上条带间的强度不同，从顶部究竟部条带逐渐减弱，出现阴影。逐渐减弱

44、，出现阴影。可用于富含二级构造的模板可用于富含二级构造的模板催化催化ddNTP结合的与该区模板结合的与该区模板DNA序列的影响序列的影响TaqDNAPol和和PfuPol催化催化ddNTP结合的速率比结合结合的速率比结合dNTP的速率低的速率低两个数量级两个数量级通用引物的运用防止了合成不同引物的费事通用引物的运用防止了合成不同引物的费事M13正反向，正反向，T7，SP6等等M13 PrimersTaKaRa 公司公司 M13 Primer各引物位各引物位置图置图 形状形状 冻结枯燥品。可用灭菌水或冻结枯燥品。可用灭菌水或TE Buffer (pH 7.58.0) 溶解后运用溶解后运用用途用途 作为具有作为具有SP6 Promoter载体的测序用引物或载体的测序用引物或PCR用引物用引物 5.2化学法测序化学法测序(Maxam-Gilbert procedure) 经凝胶电泳按大小分别和放射自显影后，根据经凝胶电