牛血清白蛋白分离提纯工艺

1、课程设计说明书课程名称：生 物 分 离 工 程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼学号： 4 1 0 0 4 0 2 0 1 1 1 专业班级： 10 级生物工程 01 班 指导教师：王晓军2013 年 6月 20 日目录1. 设计任务书2. 设计背景 . 12.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 12.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义. 13. 设计原理 24. 设 计工艺 流程及 设计方 案说明 24.1 对原材料的粗分级分离 34.2 对粗分离成分进行细分级分离 34.3 蛋白的结晶与重结晶 34.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 . 34.5 牛

2、血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 35. 操作过程 . 45.1 蛋白质分离的准备阶段 45.2 细分级分离设备的设计 45.3 蛋白质的纯度鉴定 86. 参考文献 . 897. 课程 设计心 得1. 设计任务书现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量： 57000Da，pI 4.5 ）、-乳 球蛋白（分子量： 35000Da，pI 5.1 ）、- 乳白蛋白（分子量： 14000Da，pI4.2 ）和牛血清白蛋白（分子量： 66200Da，pI 4.7 ），设计一个分离纯化工 艺纯化其中的牛血清白蛋白。2. 设计背景2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介蛋白质是（ protein ）是生命的物质基础

3、，没有蛋白质就没有生命。因 此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的 每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的 16%20%，即一个 60kg 重的成年人其体内约有蛋白质 9.612kg 。人体内蛋白 质的种类很多，性质、功能各异，但都是由 20 多种氨基酸按不同比例组合 而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质具有很多生物化学共性， 运用相关性质进行蛋白质的分离制备多 种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成 熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的 不同原理对其进行分离纯化， 单一蛋白质的

4、分离提纯在现实生活中具有重要 意义！2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（ 38g/100ml ），分子量 68kD。等电点 4.8 。含氮量 16%，含糖量 0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有 0.2%。白蛋白由 581个氨基酸残基组成，其中 35 个半胱氨酸组成 17个二硫键，在肽链的第 34 位有一自由巯基白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、 PH缓冲作用、 载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和 机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（ BSA），又称第五组分，是牛血清

5、 中的一种球蛋白，包含 583 个氨基酸残基，分子量为 66200Da，等电点为 4.7 牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在 western blot 中作为 Blocking agent 。3. 设计原理 采用等电点沉淀、凝胶过滤、亲和层析等方法对蛋白质进行分离提纯， 对相关分离提纯所需条件可通过与电脑相连的方式进行精确控制， 并在此基 础设计相关仪器分离提纯蛋白质， 在分离提纯过程中运用到的蛋白质一些性 质：分子大小、溶解度、等电点、吸附特性等。根据生物分离原则：先纯化，再脱盐，最后成品加工。初步纯化采用盐 析沉淀法，高度纯 化采用二维电泳。盐析沉淀原理： 蛋白质在水溶液中的溶解

6、度是由蛋白质周围亲水基团与 水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐 加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周 围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强 度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋 白质分子之间聚集而沉淀。4. 设计工艺流程及设计方案说明4.1 对原材料的粗分级分离当蛋白质提取液获得后，选用一套适当的方法，将所要的蛋白质与其他 杂蛋白分离开来。一般该步分离用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等 方法。4.2 对粗分离成分进行细分级分离这一步也就是样品的进一步纯化。样品经粗分级分

7、离以后，一般体积较 小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化，一般使用层析法，还可以选用电 泳、等电聚焦作为最后的纯化步骤。等电聚焦电泳就是使电泳的介质中形成一定范围的 pH梯度，电泳时待 分离的两性分子可以在这种 pH梯度中迁移，直到聚集于与其等电点相同的 区域。该技术特别适用于分子量相近而等电点不同的蛋白质分离和分析。我们在设计完成自己创新的蛋白质电荷分离仪时就是依据等电聚焦的 相关原理完成的， 因此等电聚焦电泳分离蛋白质就是我们设计分离蛋白质的 基本依据。4.3 蛋白的结晶与重结晶结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤， 结晶过程本身也伴随着一定程度的 纯化，而重结晶又可除去少量夹杂的蛋白质。结晶并

8、不能保证蛋白质一定是 均一的，但只有某些蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 蛋白质纯度鉴定通常采用物理化学的方法， 如电泳、 沉淀、HPLC和溶解 度分析等。纯的蛋白质和还有杂质的蛋白质在电泳等测量时会表现出不同的 动向故而能够进行纯度的鉴定。4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程工艺流程：动植物组织或细胞，细菌细胞裂解破碎得到蛋白质提取液通过盐析、等电点沉淀等方法除去其中的杂质的到体积较小，杂蛋白较少的蛋白提取液经过层析、电泳、等电聚焦等方法进一步分离纯化蛋白 结晶重结晶纯度的鉴定纯度过低时重复以上几步操作得到单一牛 血清白蛋白5. 操作过程

9、5.1 蛋白质分离的准备阶段方法: 盐析其原理由于大量中性盐的加入使水的活度降低， 原来溶液中的大部分甚 至全部的自由水变成了盐离子的水化水， 那些被迫与蛋白质表面的疏水基团 接触并掩盖它们的水分子成为下一步最自由地可以利用的水分子， 因此留下 暴露出来疏水基团的蛋白质，随硫酸铵的进一步加入，蛋白质疏水基团进一 步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集沉淀。在上步溶有蛋白质的缓冲液内加入中性盐硫酸铵，随着硫酸铵的加入， 当离子浓度足够高时，缓冲液中的蛋白质会沉淀下来，这样就得到了蛋白质 的粗提物，这步主要利用了盐析原理。通过以上两个步骤完成蛋白质的初级分离， 为下一步细分级分离做好准 备。5.2 细分级

10、分离设备的设计基于蛋白质分离的准备阶段，对所要的目的蛋白进行分离创新设计仪器名称：蛋白质电荷分离仪所设计仪器原理：蛋白质在非等电点溶液中带电，在外加电场作用下会 向相反电极移动；蛋白质在等电点时溶解度最低且不带电荷，在外加电场下 不会移动。 精确控制分离缓冲液的 pH，利用电泳作用分离带点蛋白质和不带 电蛋白质。主要过程包括以下两方面要点： a、精确地控制反应容器内液体的 pH，b、 自由电泳分离带电蛋白质。所用器材：滴定管、铁架台、夹子、带孔玻璃板、下部带有出口圆形玻 璃器皿、磁力搅拌器、 pH计、电脑、电极、电源、透析纸袋等。蛋白质电荷分离仪的主要构成：固定装置、反应装置、搅拌装置、控制

11、装置、电泳装置。仪器介绍：a. 固定装置主要组成：铁架台、夹子、玻璃板等 主要用途：用于固定滴定管，方便调节 pH的液体（酸、碱、水）的滴 加，再者固定与电极相连的电线，使装置处于相对比较稳定的状态。此装置 位于分离仪器的最上部。b. 反应装置主要组成：下部带有出口圆形玻璃器皿、透析纸袋等 主要用途：用于盛装反应液， pH计测定反应液的 pH，电泳过程等主要 反应过程都在这里面进行。此装置位于分离仪器的中部。c. 搅拌装置名称：磁力搅拌器原理 : 利用磁性物质同性相斥的特性， 通过不断变换基座的两端的极性 来推动磁性搅拌仔转动。适用于粘稠度不是很大的液体，或者固液混合物利 用了磁场和漩涡的原理

12、，将液体放入容器中后；将搅拌子同时放入液体；当 底座产生磁场后带动搅拌子成圆周循环运动，从而达到搅拌液体的目的。用途：当滴定管液体滴入反应容器时会造成反应液各处 pH不均匀，磁 力搅拌器将液体搅匀，便于下面 pH计的准确测定。d. 电泳装置组成：电极、电源、电线等分类：自由电泳、区带电泳 原理：生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基 团，称为两性离子。 常以颗粒分散在溶液中， 它们的静电荷取决于介质的 H+ 浓度或与其他大分子的相互作用 . 在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移， 迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。如果把生物 大分子的胶体溶液放在一个没有干

13、扰的电场中， 使颗粒具有恒定迁移速率的 驱动力来自于颗粒上的有效电荷 Q和电位梯度 E。用途：达到特定蛋白质等电点时，蛋白质溶解度最低且不带电荷，在外 加电场作用下不会向两极移动； 其它蛋白质在特定蛋白质的等电点时不是它 们自己的等电点，因此带点，在外加电场下会移动。用 pH计精确控制分离 缓冲液的 pH，达到特定蛋白质的等电点， 让后自由电泳， 将特定蛋白质与其 它蛋白质分离开来。e. 控制装置名称： pH 计组成： 一个参比电极； 一个玻璃电极， 其电位取决于周围溶液的 pH；一 个电流计，该电流计能在电阻极大的电路中测量出微小的电位差。分类： 1.按测量精度可分 0.2 级、0.1 级、

14、0.01 级或更高精度。2. 按仪器体积分有笔式（迷你型） 、便携式、台式还有在线连续监控测 量的在线式。3. 根据使用的要求笔式（迷你型）与便携式 PH酸碱度计一般是检测人 员带到现场检测使用。原理：用电位法测定溶液的 pH值是最基本的方法。 电位测量 pH 的原理 来源于能斯特公式。 如把一支对氢离子可逆的电极和一支参比电极放人溶液 中，就组成了原电池。由于原电池中参比电极的电位在一定条件下是不变的， 那么原电池的电动势的数值就随着被测溶液中氢离子的活度而变。因此，可 以通过测量原电池的电动势，计算溶液中的 pH值。操作过程：在带有出口圆形玻璃器皿底部铺上一层透析纸袋，将带孔玻 璃板盖在下

15、部带有出口圆形玻璃器皿上， （不易用方形玻璃器皿，因为搅拌 时候易造成液体飞溅，容器内已经注有一定 pH的缓冲液 ） ，滴定管和电极电 线穿过玻璃板孔向容器内滴加液滴（视情况滴加酸、碱、纯水，液滴的量要 精确控制，以免 pH受到较大波动），在滴加液滴的同时打开磁力搅拌器缓慢 搅拌，使溶液各处 pH均匀，在此期间经校正的 pH计严格监视溶液 pH的变 化，随液滴的滴加 pH达到被分离蛋白质的等电点（之所以没有提前加入被 分离蛋白质样品是避免 pH波动对被分离蛋白质活性的影响） ，停止滴加液滴， 加入被分离蛋白质样品， 再次测溶液 pH 并且调整溶液 pH至被分离蛋白质的 等电点。以上操作主要是为

16、了找到被分离蛋白质的等电点，并没有进行电泳 操作，上述操作完成后，停止 pH计的测量，打开电泳操作进行电泳，由于 被分离蛋白质在等电点 pH处不带电，故而不移动，其它带点蛋白质会在电 场作用下向相反电极移动（控制电压可以改变带电蛋白质的移动速度） ，从 而分离出目标蛋白质， 然后通过下部带有出口圆形玻璃器皿的出口取出被分 离液，将透析纸袋取出，获取目标蛋白质，将其储存起来，关闭出口，再换 一张透析纸袋，将出口的分离液再次倒进反应装置里，再次打开磁力搅拌器 缓慢搅拌，调整 pH至刚分离的蛋白质的等电点，然后重复上述操作，进一 步分离目标蛋白质，提高被分离蛋白质的产量。经过上述操作已经分离出所需目

17、标蛋白质，分离完后。再次调整 pH（高于刚分离蛋白质的等电点） ，让后再加入上述被分离蛋 白质的样品，重复上述操作，可用于分离比已经分离出蛋白质等电点高的所 需蛋白质，逐次可分离出多种蛋白质。完成蛋白质的分离之后，清洗仪器（尤其是 pH计电极的清洗，必须严 格清理），风干被清洗的器皿，以待下次再用。5.3 蛋白质的纯度鉴定 方法：电泳，由于纯的蛋白质所带电荷、相对分子量等都相同，所以纯 的蛋白质在一系列不同的 pH 条件下，都将以单一的速度移动，它的电泳图 谱只呈现一个条带，因此据此可以判断出蛋白质的纯度。N-末端分析也可用于鉴定纯度， 因为均一蛋白质的 N-末端残基只可能是 一种氨基酸。另外也有沉降、 HPLC、溶解度分析等方法，但无论任何单一一 种方法都只能作为蛋白质均一性的必要条件而非充分条件。6. 参考文献【1】 孙彦生物分离工程（第二版） 北京：化学工业出版社， 2005.2【2】 陈国豪.生物工程设备 .北京：化学工业出版社， 2009.5【3】 刘叶青. 生物分离工程实验 .北京：高等教育出版社， 2007.8【 4】 汪家政，范明蛋白质技术手册 . 北京：科学出版社， 2001【 5】 谭天伟生物分离技术北京：化学工业出版社， 20077. 课程设计心得经过几周的努力设计，生物分离工